G四链体抑制结肠癌细胞增殖和血管生成的研究

发布时间：2017-10-09 16:03

  本文关键词：G四链体抑制结肠癌细胞增殖和血管生成的研究

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【摘要】：目的:本实验设计合成PU22片段,体外研究其对VEGF基因表达、结肠癌细胞生长及血管生成的影响作用。方法:(1)利用生物信息学技术设计针对VEGF启动子的PU22序列,另外将PU22序列打乱设计对照序列MUTPU22,并通过基因库比对确保其特异性。(2)将带有FITC荧光标记的寡核苷酸链PU22加入结肠癌HCT116细胞和SW480细胞中,分析结肠癌细胞摄取寡核苷酸链PU22的情况。(3)提取用MUTPU22或不同浓度PU22处理的HCT116细胞和SW480细胞的总RNA,采用q RT-PCR技术检测VEGF基因m RNA表达水平,进而找出最佳作用浓度。(4)后续实验分为3组:PU22处理的实验组、MUTPU22处理的对照组和未处理的空白组。(5)提取结肠癌细胞总蛋白,通过Western blotting实验测得各组VEGF蛋白表达水平。(6)采用Annexin V-FITC法通过流式细胞仪检测PU22对细胞凋亡的影响;利用MTT实验观察各组结肠癌细胞的增殖变化。(7)利用HUVEC进行体外小管形成实验,检测PU22对血管形成的影响。结果:(1)利用生物信息学数据库成功筛选设计出可能作用于VEGF启动子区域的PU22序列(5'-CGGGGCGGGCCGGGGGCGGGGT-3')和对照序列MUTPU22(5'-CGAGTCGCGCCGAGTGCGAGAT-3')。通过基因库比对序列具有较高的特异性。(2)利用细胞摄取实验检测PU22已成功的被结肠癌细胞摄取,且摄取率高达90%。(3)荧光实时定量PCR实验结果显示人结肠癌细胞HCT116和SW480经不同浓度PU22作用后,细胞中VEGF基因RNA的表达量皆有降低,其中浓度为8μM时作用最明显,最佳作用时间为48小时,SW480细胞作用效果优于HCT116细胞,其中8μMPU22作用SW480细胞48小时后,VEGF基因m RNA表达量为0.027±0.002。结果表明PU22序列可以抑制VEGF基因m RNA的表达。(4)Western blotting检测结果显示经过不同条件处理HCT116细胞48h后,实验组灰度值(0.074±0.007)明显皆小于空白组(0.737±0.034)和对照组(0.513±0.013),且皆有统计学差异(P0.05);72h后实验组灰度值(0.252±0.094)略小于空白组(0.466±0.063)和对照组(0.396±0.119);经过不同条件处理SW480细胞48h后实验组灰度值(0.029±0.001)皆明显小于空白组(0.572±0.127)和对照组(0.488±0.034),且都有统计学差异(P0.05),72h后实验组灰度值(0.113±0.009)皆明显小于空白组(0.635±0.061)和对照组(0.481±0.007),且都有统计学差异(P0.05)。结果表明人结肠癌HCT116和SW480细胞经不同条件作用后,细胞中VEGF蛋白的表达量皆有降低,说明设计的外源G四链体PU22可以抑制VEGF基因蛋白的表达。(5)Annexin V-FITC法检测各组细胞48h后的凋亡情况。结肠癌HCT116细胞实验组的凋亡率(42.46%±2.03%)高于对照组(28.78%±1.87%),结果具有统计学差异(P0.05)。SW480细胞实验组的凋亡率(69.14%±1.77%)大于对照组(32.95%±2.18%),结果具有统计学差异(P0.05)。结果表明PU22可以诱导HCT116与SW480细胞凋亡。(6)MTT实验结果显示:从72h起,实验组结肠癌细胞的增值水平显著低于空白组跟对照组,此时SW480细胞实验组、对照组、空白组的OD450分别为0.247±0.067、0.408±0.034、0.423±0.115;HCT116细胞实验组、对照组、空白组的OD450分别为0.402±0.193、0.896±0.074、0.921±0.127。说明外源G四链体PU22可以抑制结肠癌HCT116和SW480细胞的增殖能力。(7)小管形成实验结果显示:PU22作用结肠癌细胞后,HCT116细胞实验组、对照组、空白组血管的形成数分别为11.5±1.81、24.5±0.97、26±2.62;SW480细胞实验组、对照组、空白组血管的形成数分别为8.27±2.04、21.3±1.66、21.5±0.91。实验组的血管生成率明显小于对照组和空白组,且管腔不完整,说明PU22可以抑制体外血管生成。结论:结肠癌细胞HCT116和SW480成功摄取寡核苷酸PU22序列后可以抑制VEGF基因的表达,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。其细胞分泌物也可抑制HUVEC体外血管生成能力。其作用机制可能与基因启动子区域G四链体的形成有关,本研究为结肠癌的治疗提供新的思路和方法。
【关键词】：VEGF G四链体 PU22 血管生成
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-12
• 前言12-15
• 1 材料与方法15-31
• 1.1 实验材料15-20
• 1.2 实验方法20-31
• 2 结果31-41
• 2.1 结肠癌细胞摄取PU22 情况31
• 2.2 PU22 下调结肠癌细胞VEGF基因RNA表达31-33
• 2.3 PU22 下调结肠癌细胞VEGF蛋白表达33-35
• 2.4 PU22 诱导结肠癌细胞凋亡35-36
• 2.5 PU22 结肠癌细胞增殖能力36-38
• 2.6 PU22 抑制HUVEC体外血管生成38-41
• 3 讨论41-44
• 4 结论44-45
• 参考文献45-48
• 综述48-60
• 参考文献57-60
• 致谢60-61
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果61-62
• 个人简介62

【参考文献】

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本文编号：1001097