LukS-PV通过miR-125a-3p调控白血病细胞凋亡的机制研究

发布时间：2017-10-09 17:06

  本文关键词：LukS-PV通过miR-125a-3p调控白血病细胞凋亡的机制研究

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【摘要】：目的：LukS-PV是由金黄色葡萄球菌分泌的PV-杀白细胞素(PVL)双组分之一,本课题组经前期研究发现重组LukS-PV在体内外具有促进急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞株HL-60凋亡和分化的作用,并且能够在体外促进AML细胞株THP-1的分化。本实验进一步研究LukS-PV对人单核细胞白血病细胞THP-1是否有促凋亡作用以及对AML病人细胞是否有抗白血病作用,并探讨其作用机制,为寻求白血病新的靶向治疗药物奠定基础。方法：(1)体外培养THP-1细胞至对数生长期,分别加入0.25,0.50,1.00μMLukS-PV作用THP-1细胞,24h后流式细胞术检测细胞凋亡率。(2)收集培养AML病人的原代细胞,加入1.00 μM LukS-PV,24h后流式细胞术检测细胞凋亡率。(3)使用1.00 μM LukS-PV刺激不同来源的AML病人的原代细胞和THP-1细胞,24h后实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-125a-3p的表达量。(4)构建miR-125a-3p过表达和抑制表达慢病毒载体并转染THP-1细胞,使用1.00 μM LukS-PV刺激转染后的THP-1细胞,24h后Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白。(5)采用生物信息学预测技术对miR-125a-3p的靶基因进行预测,筛选凋亡相关基因,使用双荧光素酶报告基因实验对筛选的靶基因进行验证。结果：(1) LukS-PV促进THP-1细胞的凋亡,并且凋亡作用呈剂量依赖性。(2)LukS-PV能够促进AML病人的原代细胞的凋亡。(3)经过LukS-PV刺激之后,THP-1细胞和AML病人的原代细胞中miR-125a-3p的表达量显著升高。(4)miR-125a-3p的过表达可以促进THP-1细胞的凋亡。(5) miR-125a-3p的低表达可以减少LukS-PV引起的THP-1细胞的凋亡。(6)双荧光素酶报告基因实验证实Bcl-2是miR-125a-3p的直接靶基因。结论：(1) LukS-PV可以促进THP-1细胞的凋亡并呈剂量依赖性。(2) LukS-PV可以促进急性髓系白血病原代细胞的凋亡。(3)LukS-PV可能通过miR-125a-3p/Bcl-2通路调控急性髓系白血病细胞的凋亡。
【关键词】：PV-杀白细胞毒素 白血病细胞 凋亡 miR-125a-3p 细菌毒素
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料和方法13-22
• 2.1 实验材料13-16
• 2.1.1 实验仪器13-14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 主要试剂配置15-16
• 2.2 临床材料16
• 2.3 实验方法16-22
• 2.3.1 THP-1细胞的培养16
• 2.3.2 AML病人原代细胞的分离和培养16-17
• 2.3.3 LukS-PV蛋白表达和纯化17-18
• 2.3.4 Bradford蛋白浓度测定18
• 2.3.5 Annexi nV/PI荧光双染—流式细胞仪检测细胞凋亡18
• 2.3.6 RNA的提取,miR-125a-3p的逆转录和荧光定量PCR18-19
• 2.3.7 慢病毒的构建和转染19-20
• 2.3.8 caspase3活性检测20
• 2.3.9 Western blotting检测凋亡相关蛋白20-21
• 2.3.10 miR-125a-3p靶基因预测和验证(双荧光素酶报告基因)21-22
• 2.4 统计学处理22
• 3 结果22-34
• 3.1 LukS-PV促进THP-1细胞凋亡的检测22-23
• 3.2 LukS-PV促进AML原代细胞凋亡的检测23-26
• 3.3 LukS-PV刺激AML细胞株和AML原代细胞后miR-125a-3p表达量的检测26-28
• 3.4 miR-125a-3p的过表达可以促进THP-1细胞的凋亡28-30
• 3.5 miR-125a-3p的低表达可以减少LukS-PV引起的THP-1细胞的凋亡30-31
• 3.6 双荧光素酶报告基因实验证实Bcl-2是miR-125a-3p的直接靶基因31-34
• 4 讨论34-39
• 5 结论39-40
• 参考文献40-44
• 附录44-45
• 致谢45-46
• 综述46-54
• 参考文献51-54

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本文编号：1001367