靶向IncRNA MALAT1的食管癌基因治疗研究

发布时间：2017-10-12 08:40

  本文关键词：靶向IncRNA MALAT1的食管癌基因治疗研究

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【摘要】：背景：近些年食管癌严重威胁了我国人民的生命健康,化疗、手术和放疗等治疗方法的预后较差。新的治疗方法是从基因层面寻求癌症解决方案,是目前研究的热点之一,具体来讲基因治疗是利用病毒或者非病毒载体携带相关基因进入细胞后影响生物学进程,首先保证特定外源基因和基因载体结合紧密,避免被体外核酸酶降解,逃脱免疫系统破坏,然后内吞入细胞,逃避细胞内溶酶体降解,最后目的基因进入核内发挥作用,导致致癌基因的沉默、抑癌基因的激活及肿瘤血管生成基因的抑制等,抑制癌症的发生发展。肿瘤的基因治疗具有安全性高、靶向性强且高效的优点,近年来取得的越来越多肿瘤病因的分子机制研究进展,更加进一步促进了肿瘤基因治疗这项新技术的应用。本文基因治疗涉及靶向的MALAT1是一种长链非编码RNA,在很多癌症的转移及复发中有不同程度的上调,基因治疗靶向lnc RNA是通过miRNA的作用,miRNA是一种长约20～25个核苷酸非编码单链RNA,本文中研究涉及的两种分别是miR-101和miR-217,被发现在很多肿瘤中下调。目的：本文首次将新的基因载体PER-PGEA、带叶酸配体的基因载体PER-PGEA-FA携带特定的miRNA进入食管癌细胞中,靶向lncRNA MALAT1,并且研究对食管癌细胞的实际影响,为未来的体内基因疾病治疗提供了可能。方法：本文设计实验思路之后,确定靶向促癌基因lncRNA MALAT1,分析确定可以靶向lncRNA的miR-101和miR-217,基因载体是利用合作实验室最新合成的阳离子聚合物PER-PGEA和带叶酸配体PER-PGEA-FA,首先通过绿色荧光蛋白实验和荧光素酶报告基因实验,研究新基因载体和质粒DNA结合条件,然后确定基因载体转染能力,并研究基因载体和特定miRNA最佳络合条件,通过测粒径和电位初步判断络合的最佳氮磷比,MTT实验研究基因载体与miRNA复合物对细胞的毒性,RT-qPCR测基因载体络合miRNA后转染在多种食管癌细胞中实际效率。接下来用RT-qPCR检测基因载体携带特定miRNA转染后对hcRNA MALAT1调控,最后研究基因载体携带miRNA进入肿瘤细胞后的生物学影响,划痕实验研究对肿瘤细胞迁移和增殖影响,计数实验研究对肿瘤细胞增殖影响,单细胞克隆形成实验研究较长时间内肿瘤细胞单克隆增殖的影响,侵袭实验研究对肿瘤细胞侵袭转移影响。结论：本实验取得初步成功,特定的miRNA可利用合作实验室最新基因载体PER-PGEA和带叶酸配体的基因载体PER-PGEA-FA络合高效转染食管癌细胞,分别研究出质粒DNA、miRNA与新基因载体的最优络合转染氮磷比,同时兼顾低毒安全和高效转染,特定的miRNA利用基因载体进入食管癌细胞之后,能靶向调控促癌IncRNA MALAT 1,并能够影响食管癌肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭等。并且验证带叶酸配体的基因载体PER-PGEA-FA效果要略优于不带叶酸配体的PER-PGEA。癌症分子生物学研究结合新基因载体研发技术是一种潜力巨大的基因治疗策略,拥有特异性高、安全性强等优点,给人们的疾病治疗带来的巨大希望,具有较好的临床应用前景。
【关键词】：靶向 MALAT1 基因治疗 食管癌
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1;R450
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-16
• 符号说明16-17
• 第一章 绪论17-31
• 1.1 引言17-18
• 1.2 miRNA和lncRNA简介18-22
• 1.2.1 miRNA-10118-19
• 1.2.2 miR-21719-20
• 1.2.3 MALAT120
• 1.2.4 miRNA与lncRNA20-21
• 1.2.5 miRNA与食管癌关系21-22
• 1.3 基因治疗22-23
• 1.3.1 抑癌基因治疗22
• 1.3.2 基因沉默治疗22-23
• 1.3.3 针对肿瘤血管生成相关基因的治疗23
• 1.4 阳离子聚合物载体23-27
• 1.4.1 简介23-24
• 1.4.2 基因载体运转及影响因素24-25
• 1.4.3 体内外实验中的影响因素25-27
• 1.4.3.1 毒性影响25-26
• 1.4.3.2 体外实验中的影响因素26-27
• 1.4.3.3 体内实验中的影响因素27
• 1.5 转染27-28
• 1.6 研究的基础28-29
• 1.7 立题背景与研究意义29-31
• 第二章 基因载体在食管癌细胞中的转染研究31-67
• 2.1 实验细胞、材料和设备31-35
• 2.1.1 实验材料31-33
• 2.1.2 实验所用细胞系33
• 2.1.3 实验相关溶液配制33-34
• 2.1.4 实验相关仪器34-35
• 2.2 实验方法35-50
• 2.2.1 文献查询35-36
• 2.2.2 细胞培养相关实验36-37
• 2.2.2.1 培养基的配置36
• 2.2.2.2 复苏和冻存36
• 2.2.2.3 培养36-37
• 2.2.2.4 传代37
• 2.2.2.5 细胞计数与铺板实验37
• 2.2.3 阳离子聚合物基因载体性能研究实验37-50
• 2.3.3.1 基因载体准备37-38
• 2.2.3.2 质粒复合物溶液与miRNA复合溶液配置38-40
• 2.2.3.4 荧光素酶报告基因实验40
• 2.2.3.5 绿色荧光蛋白实验40-41
• 2.2.3.6 粒径与表面电荷实验41
• 2.2.3.7 AFM实验41
• 2.2.3.8 细胞毒性实验41-42
• 2.2.3.9 检测miRNA转染效率实验42-47
• 2.2.3.10 转染miRNA对靶基因MALAT1影响47-50
• 2.3 实验结果与讨论50-64
• 2.3.1 荧光素酶实验50-52
• 2.3.2 绿色荧光蛋白(EGFP)实验52-53
• 2.3.3 粒径和表面电位测定53-55
• 2.3.4 AFM原子力显微镜检测55-56
• 2.3.5 毒性MTT实验56-58
• 2.3.6 检测miRNA转染效率实验58-61
• 2.3.7 转染miRNA对靶lncRNA MALAT1影响61-64
• 2.4 小结64-67
• 第三章 基因载体在食管癌细胞生物学性能的研究67-81
• 3.1 实验细胞、材料和设备67-69
• 3.1.1 实验细胞培养材料67
• 3.1.2 生物学性能检测试剂67
• 3.1.3 实验所用细胞系67
• 3.1.4 实验相关仪器67-69
• 3.2 实验方法69-71
• 3.2.1 划痕实验69
• 3.2.2 计数实验69
• 3.2.3 单克隆形成实验69-70
• 3.2.4 侵袭实验70-71
• 3.3 实验结果与讨论71-79
• 3.3.1 划痕实验71-75
• 3.3.2 计数实验75-76
• 3.3.3 单克隆形成实验76-78
• 3.3.4 侵袭实验78-79
• 3.4 小结79-81
• 第四章 结论和创新点81-82
• 4.1 结论81
• 4.2 创新点81-82
• 参考文献82-86
• 致谢86-87
• 研究成果及已发表的论文87-88
• 作者和导师简介88-89
• 附件89-90

【共引文献】

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本文编号：1017752