康莱特注射液联合吉非替尼对人肺腺癌NCI-H1975细胞株的作用研究

发布时间：2017-10-13 07:18

  本文关键词：康莱特注射液联合吉非替尼对人肺腺癌NCI-H1975细胞株的作用研究

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【摘要】：目的:如今肺癌的发病率已位于我国恶性肿瘤首位。由于肺癌的早期症状较为隐匿,确诊时大多数病人已属于晚期。化疗是肺癌治疗的基石,但化疗的不良反应较大,且疗效已达到平台期,随着分子靶向治疗的出现,晚期非小细胞肺癌的治疗也由传统的化疗转向以基因分型为指导的分子靶向治疗。其中应用较多的是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类药物,如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等。但随着EGFR-TKI类药物的广泛应用耐药问题也相应产生,其中T790M突变约占EGFR-TKI耐药的50%~60%。而我国传统中医药在抗肿瘤治疗中有其特殊功效,因此人们开始探索将传统中药与EGFR-TKI类药物联合应用能否解决EGFR-TKI类药物耐药问题。康莱特注射液是一种以薏苡仁为主要成份的中药,它对多种肿瘤细胞具有抗肿瘤作用,尤其对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞有较强的抑制和杀伤作用。目前研究证明PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路在NSCLC的凋亡、增殖、侵润等一系列生物学过程中具有重要作用。本研究拟通过将吉非替尼、康莱特注射液以及吉非替尼联合康莱特注射液不同干预处理,作用于T790M基因突变的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐药细胞株,并检测各处理组的细胞生长抑制情况,各处理组在PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路中Akt和MAPK1(ERK2)基因的表达情况以及相应p-Akt和p-ERK蛋白表达情况,来对康莱特注射液联合吉非替尼对存在T790M突变的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐药细胞株的作用及其机制进行探索研究。方法:1体外培养人肺腺癌NCI-H1975细胞,选取对数生长期细胞进行实验。实验分为空白对照组,吉非替尼组,康莱特注射液组,吉非替尼联合康莱特注射液组;吉非替尼组设置浓度分别为:0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L,作用时间分别为:24h、48h、72h;康莱特注射液组设置浓度分别为:5μl/ml、10μl/ml、20μl/ml、40μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、160μl/ml,作用时间分别为:24h、48h、72h;应用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法分别测定吉非替尼组和康莱特注射液组的不同浓度、不同作用时间的抑制率绘制生长曲线,并分别计算吉非替尼组30%抑制率所对应浓度(IC30)与康莱特注射液组50%抑制率所对应浓度(IC50)。2确定联合用药组浓度及作用时间:根据MTT结果,吉非替尼组IC30=25μl/ml,康莱特注射液组IC50=40μl/ml,故联合用药组吉非替尼取25μl/ml,康莱特注射液取40μl/ml,作用时间为48小时,应用MTT法检测定各时间联合用药组的抑制率。3取对数生长期细胞,按上述分组进行处理。药物作用48h后提取总RNA,检测总RNA的量、纯度及浓度,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量检测各组细胞内Akt基因和MAPK1(ERK2)基因的m RNA的表达水平。4选取对数生长期细胞置入六孔板培养,分组处理同上。药物作用48h后提取总蛋白,检测总蛋白浓度,蛋白质印迹(Western-blot)法检测各组p-Akt与p-ERK蛋白表达情况。5运用IBM SPSS Statistics 22.0.0.0统计软件对数据进行处理。结果:1 MTT结果显示:1.1与对照组相比,随着康莱特注射液组浓度增加及作用时间的延长,对人肺腺癌NCI-H1975细胞的抑制率逐渐升高,其抑制作用有剂量及时间依赖效应;吉非替尼单药24h组随药物浓度的升高,在0.1-5μmol/l范围内未见其对人肺腺癌NCI-H1975细胞有明显抑制情况,在10-50μmol/l范围内出现对人肺腺癌NCI-H1975细胞生长轻度抑制,在吉非替尼单药48h、72h组对人肺腺癌NCI-H1975细胞的抑制率逐渐升高,呈时间、剂量依赖关系。1.2联合用药组:吉非替尼联合康莱特注射液培养48h后,两药联合作用抑制率高于各单药组,有统计学意义(P0.05)。2 RT-PCR结果显示:吉非替尼组、康莱特注射液组以及吉非替尼联合康莱特注射液组与对照组相比,Akt和MAPK1(ERK2)基因的m RNA的表达水平均有所下调,其中以联合组下调最为明显,有统计学意义(P0.05);3 Western-blot结果显示:吉非替尼组、康莱特注射液组以及吉非替尼联合康莱特注射液组与对照组相比,p-AKT蛋白和p-ERK蛋白的表达水平均有所下调,其中以联合组下调最为明显,有统计学意义(P0.05)。结论:1康莱特注射液和吉非替尼单独应用对人肺腺癌NCI-H1975细胞生长均有抑制作用,而两药联合抑制作用增强,具有协同增效作用。2康莱特注射液和吉非替尼单独应用均能下调Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平,而两药联合对Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平下调作用更显著。3康莱特注射液具有一定逆转人肺腺癌NCI-H1975细胞耐吉非替尼的作用,可能与下调耐药细胞内Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平相关。
【关键词】：吉非替尼 康莱特注射液 耐药 癌 非小细胞肺 Akt ERK
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-22
• 结果22-24
• 附图24-27
• 附表27-31
• 讨论31-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 综述 晚期非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药机制及其研究进展40-52
• 参考文献46-52
• 致谢52-53
• 个人简历53

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本文编号：1023519