KIAA2018在骨肉瘤中的作用及其调控miRNAs的鉴定

发布时间：2017-10-13 11:22

  本文关键词：KIAA2018在骨肉瘤中的作用及其调控miRNAs的鉴定

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【摘要】：骨肉瘤是一种以骨质破坏为特征的恶性肿瘤,是干细胞向成骨细胞分化过程中受遗传或表观遗传变化影响的一种分化缺陷疾病。Runx2是骨肉瘤原癌基因,在骨肉瘤细胞中Runx2介导的成骨分化是紊乱的。KIAA2018隶属于bHLH转录因子超家族,目前尚无文献报道该基因的功能。在人bHLH家族中,KIAA2018与C亚类中的AP-1亲缘关系最近,同属于E-Box调节因子。AP-1能通过Runx2 P1基础核心启动子上DNase敏感区域中的HLH/E-box(一种蛋白/DNA互作结构域),靶向调控骨肉瘤原癌基因Runx2的转录,此外,骨肉瘤中血管生成、骨肉瘤细胞迁移、侵袭、转移等过程所需的关键因子也都是其直接调控的下游基因。miRNA可通过碱基互补配对原则识别靶基因3’UTR上结合位点,在转录后水平以mRNA降解或抑制蛋白翻译的方式负调控靶基因,进而参与疾病发生等多种生理过程。哺乳动物中,大约90%的基因可受miRNA的调控。本研究的目的是：1)在人骨肉瘤Saos-2细胞中抑制KAA2018表达,研究其对骨肉瘤原癌基因Runx2转录的影响；2)鉴定调控KIAA2018的miRNAs;3)筛选KIAA20183'UTR区的miRNA相关SNP。方法1.通过shRNA慢病毒介导构建KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞模型,qPCR检测对照组Saos-2细胞和KIAA2018敲降型Saos-2细胞中Runx2在mRNA水平上的差异。2.运用Diana-micro、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、 Targetscan、miRWalk9种miRNA靶基因分析工具,预测可能调控人KIAA2018的miRNA,后运用荧光素酶报告基因法进行实验验证；之后,再进一步合成相应miRNA的模拟物和抑制剂转染293T细胞,利用qPCR检测内源性miR-27a的表达变化对KIAA2018的影响。3.首先运用miRNASNPv2.0、mrSNP和SNPinfo筛选KIAA20183'UTR区的miRNA相关SNP,然后对候选SNP分别构建插入野生型KIAA20183'UTR和突变型KIAA20183'UTR的psi-CHECK2重组表达载体以及插入相应pre-miRNA的pCMV-MIR重组载体,最后运用双荧光素酶报告基因法进行检测。结果1.利用PHBLV-U6-GFP-T2A-Puro慢病毒载体系统,成功构建了KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞模型,qPCR结果显示与正常Saos-2细胞相比,KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞中RUNX2的mRNA水平降低至约34%。2.运用Diana-micro、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、 Targetscan和miRWalk分析KIAA2018基因,Diana-microT、miRanda、miRDB和TargetSacan显示KIAA2018可能受miR-27a、miR-96、miR-199a和miR-216a调控；而分析这4个miRNA可能的靶基因时,只有miR-27a的靶基因中含有KIAA2018。 TargetScan分析结果揭示miR-27a成熟序列中与KIAA2018作用的8个碱基在脊椎动物中高度保守。双荧光素酶报告基因检测证实miR-27a调控KIAA2018的表达。进一步检测miR-27a对内源性KIAA2018转录的影响,qPCR结果显示转染miR-27a mimics提高内源性miR-27a表达,引起KIAA2018 mRNA水平下调40.4%(p0.01)；而转染miR-27a inhibitor抑制内源性miR-27a表达,引起KIAA2018 mRNA水平上调39.8%(p0.01)。3. KIAA2018 3'UTR区上的两个SNP rs9814605 (chr3:113372048, T/C)和SNPrs13065268 (chr3:113372047, G/A)能影响miR-513a-5p与KIAA2018的结合。当SNPrs9814605位点由T→C时,miR-513a-5p不能与KIAA2018结合(p0.01)；当SNPrs13065268位点由G→A时,miR-513a-5p不能与KIAA2018结合(p0.01)。荧光素酶报告基因实验检测结果与预测一致,且发现当rs9814605为T等位基因,同时rs13065268为G等位基因时,它们共同引起的miR-513a-5p对KIAA2018的下调作用显著增强。结论1. KIAA2018可通过调控骨肉瘤原癌基因Runx2在骨肉瘤中发挥作用。2. miR-27a可能调控KIAA2018的表达与骨肉瘤相关联。3. KIAA2018 3'UTR的SNP rs9814605和SNPrs13065268能影响与骨肉瘤有关的miR-513a-5p与KIAA2018的结合。
【关键词】：骨肉瘤 KIAA2018 Runx2 miRNA SNP
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 骨肉瘤相关基因研究进展12-16
• 1.1.1 抑癌基因12-13
• 1.1.2 原癌基因13-14
• 1.1.3 新型研究热点-Runx2基因14-16
• 1.2 KIAA2018基因16-18
• 1.2.1 bHLH转录因子超家族成员——KIAA201816
• 1.2.2 KIAA2018的亲缘性蛋白——AP-116-18
• 1.3 miRNA18-20
• 1.3.1 miRNA的生成和作用机制18-19
• 1.3.2 miRNA相关SNP19
• 1.3.3 miRNA与骨肉瘤19-20
• 1.4 本研究的目的与意义20-22
• 第二章 材料与方法22-37
• 2.1 材料22-26
• 2.1.1 主要材料22-24
• 2.1.2 主要试剂24-25
• 2.1.3 主要仪器25-26
• 2.2 方法26-37
• 2.2.1 细胞培养26
• 2.2.2 感受态细胞DH5α的制备26
• 2.2.3 生物信息学工具26-27
• 2.2.4 野生型重组载体构建27-30
• 2.2.5 突变型载体构建30-31
• 2.2.6 KIAA2018敲降型Saos-2细胞模型的构建31-32
• 2.2.7 细胞转染32-33
• 2.2.8 RT-qPCR33-35
• 2.2.9 双荧光素酶报告基因系统检测35-36
• 2.2.10 数据统计分析36-37
• 第三章 结果37-50
• 3.1 慢病毒介导shRNA沉默人KIAA2018对Runx2表达的影响37-42
• 3.1.1 人KIAA2018慢病毒干扰载体的构建37-39
• 3.1.2 人KIAA2018慢病毒干扰载体的包装39
• 3.1.3 慢病毒滴度测定39-41
• 3.1.4 KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞模型的构建41
• 3.1.5 KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞模型的鉴定41-42
• 3.1.6 KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞中Runx2的转录水平42
• 3.2 调控KIAA2018的miRNA的鉴定42-46
• 3.2.1 生物信息学分析42-43
• 3.2.2 双荧光素酶报告基因检测43-45
• 3.2.3 过表达外源性miR-27a对KIAA2018转录水平的影响45-46
• 3.2.4 抑制内源性miR-27A对KIAA2018转录水平的影响46
• 3.3 KIAA2018 3'UTR区miRNA相关SNP的鉴定46-50
• 3.3.1 生物信息学分析46-47
• 3.3.2 荧光素酶报告基因法检验47-50
• 第四章 讨论50-53
• 4.1 KIAA2018基因敲降型Saos-2细胞模型的构建50
• 4.2 人骨肉瘤细胞中KIAA2018沉默对Runx2转录的影响50-51
• 4.3 miR-27a/KIAA2018/骨肉瘤51-52
• 4.4 KIAA2018 3'UTR区miRNA相关SNP rs9814605和rs1306526852-53
• 参考文献53-64
• 硕士期间已发表学术成果64-65
• 致谢65

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