线粒体动力相关蛋白1在含笑内酯诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-14 06:02

  本文关键词：线粒体动力相关蛋白1在含笑内酯诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用及机制研究

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【摘要】：目的:研究线粒体动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)在含笑内酯(Micheliolide,MCL)诱导人乳腺癌细胞凋亡过程中的作用及可能涉及的分子机制。方法:重组质粒载体PCDH-p EGFP、PCDH-p EGFP-Drp1-K38A(Drp1突变体)及PCDH-p EGFP-Drp1-WT(Drp1野生型)转导慢病毒,构建稳定过表达EGFP、Drp1-K38A、Drp1-WT的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞株;免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测目的蛋白Drp1的表达水平;激光聚焦显微镜观察MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞线粒体形态;显微镜下观察MCL对乳腺癌细胞形态的影响;Hochest33342染色检测乳腺癌细胞核形态改变;MTT比色法检测MCL对乳腺癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测Annexin V-PE染色后细胞凋亡情况。JC-1染色荧光显微镜观察线粒体膜电位变化;Western Blot检测细胞色素C释放及PARP蛋白裂解;流式细胞术检测Mito SOX染色后细胞内活性氧(ROS)水平;MTT比色法检测抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸,N-acetyl-L-cysteine)对MCL抑制MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的影响。结果:1.MCL可剂量依赖性抑制MCF-7乳腺癌细胞的增殖,同时MCL可上调Drp1蛋白表达水平,促进线粒体片段化分裂。2.获得外源性EGFP、Drp1-K38A及Drp1-WT稳定过表达的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞株,激光共聚焦显微镜下观察Drp1-WT组MCF-7及MDA-MB-231细胞线粒体片段化比例较Drp1-K38A、EGFP组细胞明显增多(P0.05)。3.显微镜下观察MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞形态变化,随MCL浓度增加,MCF-7及MDA-MB-231细胞逐渐缩小变圆,细胞膜边界不清、胞膜破裂、细胞固缩死亡,与Drp1-K38A、EGFP组MCF-7及MDA-MB-231细胞相比,Drp1-WT组出现上述细胞形态变化更明显。荧光显微镜观察Hoechest33342染色的MCF-7及MDA-MB-231细胞核形态改变,与Drp1-K38A、EGFP组相比,Drp1-WT组的MCF-7及MDA-MB-231细胞出现出较多的核固缩及碎裂。4.MTT结果显示:MCL处理MCF-7及MDA-MB-231细胞48h,Drp1-WT组MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖率较Drp1-K38A及EGFP组MCF-7及MDA-MB-231细胞增殖率明显降低(P0.05)。5.细胞凋亡染色流式细胞术检测结果显示:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231细胞24h,Drp1-WT组MCF-7及MDA-MB-231细胞凋亡率较Drp1-K38A及EGFP组明显增高(P0.05)。6.流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的变化,10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231细胞24h,Drp1-WT组MCF-7及MDA-MB-231细胞内ROS水平明显高于表达Drp1-K38A及EGFP组(P0.05)。7.荧光显微镜下观察各组线粒体膜电位变化:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231细胞24h,Drp1-WT组MCF-7及MDA-MB-231细胞内线粒体膜电位水平较Drp1-K38A及EGFP组明显降低(P0.05)。8.凋亡相关蛋白检测:Western Blot结果显示:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231细胞24h,Drp1-WT组的MCF-7及MDA-MB-231细胞内细胞色素C表达水平及PARP蛋白裂解片段表达较Drp1-K38A及EGFP组明显增高。9.应用抗氧化剂NAC后,各组MCF-7及MDA-MB-231细胞对MCL敏感性明显下降,Drp1-WT组的MCF-7及MDA-MB-231细胞与Drp1-K38A及EGFP组细胞增殖率相比无显著统计学差异(P0.05)。结论:MCL可剂量依赖性抑制MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖,其机制与MCL诱导线粒体动力相关蛋白1表达,促进线粒体分裂,提高乳腺癌细胞ROS水平,耗散线粒体膜电位,促进细胞色素C释放,裂解凋亡蛋白PARP,进而诱发乳腺癌细胞凋亡有关。
【关键词】：含笑内酯 线粒体动力相关蛋白1 乳腺癌细胞 线粒体 凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 对象和方法14-25
• 1.1 材料与仪器14
• 1.2 试剂配制14-15
• 1.3 实验方法15-25
• 1.3.1 细胞培养15-16
• 1.3.2 慢病毒法建立稳定乳腺癌细胞株16-19
• 1.3.3 Western blot检测Drp1蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平19-21
• 1.3.4 激光共聚焦检测细胞线粒体形态21
• 1.3.5 光学显微镜观察细胞凋亡形态21-22
• 1.3.6 MTT比色法检测细胞增殖22-23
• 1.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡23
• 1.3.8 JC-1 染色观察细胞线粒体膜电位23-24
• 1.3.9 MitoSOX Red染色检测细胞内活性氧簇（ROS）24
• 1.3.10 统计方法24-25
• 结果25-43
• 2.1 MCL对MCF-7 细胞增殖的影响25-26
• 2.2 MCL上调Drp1蛋白表达水平并促进线粒体片段化分裂26-27
• 2.3 Drp1-WT及Drp1-K38A慢病毒包装鉴定27-29
• 2.4 建立过表达Drp1-WT及Drp1-K38A基因的乳腺癌细胞株29
• 2.5 Drp1-WT对细胞线粒体形态的影响29-31
• 2.6 Drp1促进MCL诱导乳腺癌细胞形态及细胞核改变31-33
• 2.7 Drp1增强MCL对乳腺癌细胞的增殖抑制作用33-35
• 2.8 Drp1增强MCL对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用35-36
• 2.9 Drp1增强MCL诱导的乳腺癌细胞内ROS积聚36-38
• 2.10 Drp1促进MCL对乳腺癌细胞线粒体膜电位耗散作用38-39
• 2.11 Drp1促进MCL诱导乳腺癌细胞释放细胞色素C及裂解PARP蛋白39-40
• 2.12 抗氧化剂NAC逆转MCL对乳腺癌细胞增殖抑制作用40-42
• 2.13 Drp1在MCL诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用机制分析42-43
• 讨论43-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述 Drp1生物学功能与肿瘤54-69
• 综述参考文献61-69
• 致谢69

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本文编号：1029370