HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的调控作用及其相关机制的研究

发布时间：2017-10-14 13:04

  本文关键词：HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的调控作用及其相关机制的研究

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【摘要】：背景：前列腺癌作为威胁男性健康的常见肿瘤,其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。目前,据有关报道,前列腺癌的发病率居全球男性所有恶性肿瘤发病率的第二位,死亡率居第五位。我国前列腺癌的发病率与死亡率虽比其他发达国家低很多,但近年来随着社会的进步、人口的老龄化、人们饮食习惯的改变以及医疗条件的改善呈现明显上升的趋势,已严重威胁我国男性的身体健康。由于我国幅员辽阔,有很多地方的就医环境不太理想,目前临床上发现的晚期前列腺癌较多,尽管随着我们国内医生对前列腺癌认识的不断提高,各种检查手段,如PSA、B超检查,以及不断地宣传,公众对健康知识认知程度的提高,现在越来越多比较早期的前列腺癌患者被发现,但效果依旧不尽人意,在临床治疗方面也存在效果不佳的情况。目前前列腺癌的发病机制也不甚清楚。因此,对前列腺癌的发病机制进行深入的研究,寻找特异性和敏感性都较好的前列腺癌分子标志物以及有效的治疗靶点,对我国前列腺的临床诊断和治疗都具有非常重要的科学研究价值。我国学者韩赵东等在最近研究中应用基因芯片以及双向电泳和质谱分析的方法鉴定出了前列腺癌中的2566种肿瘤蛋白,进一步通过生物信息学分析发现了60个差异性表达的肿瘤蛋白,其中有37个表达上调,而23个表达下调。而其中在前列腺癌中表达存在明显差异性的有14种基因及其蛋白产物(ACLY, CAPG,GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1 and VCL). HnRNP L全称是核内不均一核糖核蛋白L,其系hnRNP家族的一员。人HnRNP L定位于19q13.2,全长1759bp,含有17个外显子。有研究报道,hnRNP家族中的各成员在DNA损伤修复、转录、hnRNA剪接mRNA输送、降解等生物过程中发挥着重要作用。核内不均一核糖核蛋白L(HnRNPL)最早是由Pinol-Roma S等在早期转录片段中意外发现的核糖核蛋白,这种蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,目前已知其与肺癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤的发生发展关系密切,而在本课题组前期研究中也发现其能够影响生精细胞的增值和凋亡。已有研究报道hnRNP家族中的HnRNP K与前列腺癌有着紧密的关系,可能参与调控前列腺癌的增殖和凋亡,但HnRNP L与前列腺癌的关系罕见报道。本研究首先探讨HnRNP L与前列腺癌患者的各项临床指标之间的关系,进一步在体内外研究HnRNP L对前列腺癌增值、凋亡的影响并揭示其可能的分子机制,最终阐明HnRNP L在前列腺发生发展中可能扮演的角色,并为前列腺癌的临床诊断和治疗提供一种新的肿瘤分子标志物和治疗靶点。目的：1探讨HnRNP L与前列腺癌患者的各项临床指标之间的关系；2通过体内外的功能实验阐明HnRNP L与前列腺癌细胞增殖、凋亡的关系；3通过一系列分子生物学实验最终揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能发挥的分子调控机制。方法：1 HnRNP L在前列腺癌组织中的表达情况以及与各项临床病理参数的关系于西安艾丽娜生物有限公司购得一包含81例前列腺增生症样本和99例前列腺癌样本的组织芯片,通过免疫组化S-P法检测各个样本中HnRNP L的表达情况,并结合各样本的各项临床病理参数,用相关统计学方法进行关联性分析；于南方医院泌尿外科收集得10对前列腺癌和癌旁配对组织,进行组织研磨提取蛋白后进行WB检测10对配对组织中HnRNP L的表达情况。2分别敲低和过表达HnRNP L在各前列腺细胞株中的表达,研究其对前列腺癌增殖、凋亡水平的影响首先,采用Q-PCR和WB检测HnRNP L在三株前列腺癌细胞株(PC3、DU145、Lncap)中的表达情况,筛选HnRNP L表达较高和较低细胞株,对表达较高细胞株(DU145)进行慢病毒敲低处理,对表达较低细胞株(Lncap)进行慢病毒过表达处理,而对于中间表达细胞株(PC3)既进行敲低处理也进行过表达处理；进一步通过cck-8实验、Transwell侵袭实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验以及流式细胞术检测HnRNP L敲低或过表达前后,前列腺癌细胞株增殖和凋亡情况的改变。3 HnRNP L调控前列腺癌细胞增殖和凋亡的可能的分子机制通过免疫荧光、CO-IP、RIP以及pull-down等实验方法检测HnRNP L与增殖、凋亡通路中可能相互作用的蛋白或基因,进一步通过WB检测HnRNP L敲低和过表达前后增殖以及凋亡通路中各蛋白水平的改变,最终揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能的调控机制。结果：1 HnRNP L在前列腺癌组织中的表达及其表达与临床病理参数的关系1.1 HnRNP L与前列腺癌各项临床病理参数的关系免疫组化检测结果表明：在81例前列腺增生症组织中HnRNP L的阳性表达率是29.63%(n=24),而在99例前列腺癌组织中HnRNP L的阳性表达率是84.8%(n=84),二者差异具有统计学意义(p0.05)；同时,结果也表明：在前列腺癌中,HnRNP L表达情况与临床分期、病理分级呈正相关(p0.05)。随后,Western blot检测结果显示HnRNP L在前列腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织。2分别敲低和过表达HnRNP L在各前列腺细胞株中的表达,研究其表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响2.1利用慢病毒技术构建稳定转染细胞株模型Q-PCR和Western blot结果显示DU145细胞株中HnRNP L的表达水平最高,Lncap细胞株中HnRNP L的表达水平最低,而PC3细胞株中HnRNP L的表达水平居中,因此在后续实验中对DU145细胞株仅做HnRNP L稳定敲低的处理,对Lncap细胞株仅做HnRNP L稳定过表达的处理,而对PC3细胞株既进行敲低HnRNP L的处理,也进行过表达HnRNP L的处理；转染48h后,经WB检测各株细胞敲低和过表达的效率,选择构建成功的稳转细胞株模型用于后续的功能实验。2.2敲低HnRNP L的表达对前列腺癌细胞株增殖能力的影响采用CCK-8细胞活性试验检测HnRNP L敲低后对DU145细胞株和PC3细胞株增殖能力的影响,并绘制生长曲线图。统计学分析结果显示：与对照组相比,DU145和PC3细胞株中敲低组细胞的增殖能力降低,差异具有显著的统计学意义(p0.05),不同的时间点对DU145和PC3细胞株的增殖能力影响显著(p0.05),各时间点组与处理组间交互效应显著(p0.05)；平板克隆形成试验结果显示：DU145细胞株中敲低组和对照组的克隆形成率分别是42.3%和75.1%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的克隆形成率分别是31.8%和67.5%,两两比较,差异显著,具有统计学意义(p0.05)；流式细胞术对细胞周期的检测结果显示：DU145细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是53.62%和33.14%,S期细胞数百分比分别是30.37%和55.01%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是81.09%和40.13%,S期细胞数百分比分别是14.03%和28.37%,统计学分析表明DU145和PC3细胞株中敲低组和对照组的细胞数百分比具有统计学差异,提示敲低HnRNP L的表达后,前列腺癌细胞株的增殖能力受到抑制,可能是因为其细胞周期阻滞在G1期而导致。2.3过表达HnRNP L的表达对前列腺癌细胞株增殖能力的影响同理,CCK-8结果显示：Lncap和PC3细胞株中过表达组较对照组的细胞增殖能力明显增强,差异具有显著的统计学意义(p0.05)；平板克隆形成试验结果显示：Lncap细胞株中过表达组和对照组的克隆形成率分别是33.6%和25.9%,而PC3细胞株中过表达组和对照组的克隆形成率分别是79.5%和51.6%,统计学分析表明Lncap和PC3细胞株中过表达组细胞的克隆形成能力明显高于对照组,差异具有统计学意义(p0.05)；流式细胞术细胞周期检测结果显示：Lncap细胞株中过表达组和对照组的G1期细胞数百分比分别是45.60%和48.53%,S期细胞数百分比分别是36.65%和32.87%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是38.94%和36.48%,S期细胞数百分比分别是42.86%和27.55%,统计学分析表明过表达组和对照组差异明显,具有统计学意义,提示HnRNP L过表达具有促进前列腺癌细胞增殖的能力,可能是因为其加快了细胞周期的进程。2.4敲低及过表达HnRNP L对肿瘤生长能力的影响裸鼠皮下成瘤实验结果显示：PC3细胞株敲低组、对照组和过表达组肿瘤的大小差异明显,具有统计学意义(p0.05),瘤体制成蜡块并切片后经免疫组化检测发现PC3细胞株敲低组、对照组和过表达组的肿瘤组织中增殖指标Ki-67的阳性表达率分别为10.1%、42.6%和69.2%,差异具有统计学意义(p0.05),提示：与对照组相比,敲低HnRNP L能抑制肿瘤的生长,而HnRNP L过表达能促进肿瘤的生长。2.5敲低和过表达HnRNP L对前列腺癌细胞凋亡情况的影响流式细胞术对细胞凋亡的检测结果显示：敲低HnRNP L后,DU145敲低组和对照组细胞的凋亡率分别是14.7%和7.7%,而PC3敲低组和对照组细胞的凋亡率分别是44.9%和15.5%,统计学分析表明敲低组和对照组细胞的凋亡率具有统计学差异,提示敲低HnRNP L表达具有促进前列腺癌细胞凋亡的能力。过表达HnRNP L后,Lncap细胞株中过表达组和对照组的凋亡率分别是13.2%和13.9%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的凋亡率分别是9.0%和16.9%,统计学分析表明过表达组和对照组的凋亡率具有统计学差异,提示HnRNP L过表达抑制了前列腺癌细胞株的凋亡能力。3 HnRNP L调控前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制免疫荧光结果提示HnRNP L和BCL-2在PC3细胞核内具有共定位现象,而CO-IP和pull-down结果更进一步证明HnRNP L与BCL-2之间存在相互作用的关系,而RIP结果显示HnRNP L能与p53的mRNA相互作用进一步影响p53蛋白的表达,以上结果提示HnRNP L是分别通过调控p53和BCL-2的表达情况来影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡能力。结论：研究结果表明HnRNP L在前列腺癌中是高表达的,并且其与前列腺癌的临床分期和病理分级都密切相关。HnRNP L在前列腺癌中可能发挥着促进肿瘤细胞增殖和抗凋亡的作用,其作用机制可能与p53/p21/cyclin D1信号通路和bcl-2/caspase 9/caspase 3信号通路有关。总的来说,HnRNP L有望成为前列腺癌临床诊断和治疗的一种新的分子标志物和治疗靶点。
【关键词】：前列腺癌 增殖 凋亡 核内不均一核糖核蛋白L 分子机制
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 前言20-24
• 第一章 HnRNP L在前列腺癌组织中的表达及其表达与临床病理参数的关系24-33
• 一、材料和方法24-28
• 二、结果28-31
• 三、讨论31-33
• 第二章 HnRNP L表达上调或下调后对前列腺癌增殖、凋亡等生物学特性的影响33-54
• 一、材料与方法33-40
• 二、结果40-52
• 三、讨论52-54
• 第三章 HnRNP L调控前列腺癌细胞增殖和凋亡的分子机制的初步研究54-70
• 一、材料与方法54-60
• 二、结果60-66
• 三、讨论66-70
• 全文总结70-72
• 参考文献72-81
• 硕士期间发表论文情况81-82
• 致谢82-84

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1 周许敏;HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的调控作用及其相关机制的研究[D];南方医科大学;2016年

2 何金参;HnRNP L在前列腺癌中的功能研究[D];南方医科大学;2013年

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本文编号：1031187