重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF-7作用的研究

发布时间：2017-10-16 05:45

  本文关键词：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞MCF-7作用的研究

  更多相关文章： 重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 凋亡 活性氧 MCF-7细胞 核转录因子-κB

【摘要】：乳腺癌作为一种高发性肿瘤,它的预防和治疗在生物界和医学界越来越受到重视,寻求一种新型有效且低毒性的抗乳腺癌药物迫在眉睫。近年来植物来源的胰蛋白酶抑制剂预防和抵制癌症的功能已成为一个热点受到特别关注。本课题组前期研究发现：来自荞麦中的重组胰蛋白酶抑制剂rBTI(recombinant buckwheat trypsin inhibitor)可以抑制人类白血病细胞(K562,HL60)以及人类实体瘤细胞HepG2, EC9706 等的增殖,并促进细胞凋亡。但rBTI抑制肿瘤细胞增殖以及其促进细胞凋亡的机制和分子靶点还尚不明确。研究发现,NFKB/p65信号通路在乳腺癌细胞的产生和发展中起着较为关键的作用。为了探究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI对人乳腺癌细胞MCF-7的作用及其机制,本研究主要开展以下研究内容：1、采用MTT法进行检测,发现rBTI能够明显的抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并呈现出一种剂量依赖的方式。划痕愈伤实验表明rBTI可抑制MCF-7细胞迁移。用不同浓度的rBTI对MCF-7细胞进行处理后,通过流式细胞术对MCF-7细胞周期和凋亡情况进行检测,发现细胞周期进程受到阻滞并出现明显的凋亡现象。qRT-PCR和Western Blot检测周期相关因子p53、CDK1、CDK2及细胞凋亡相关因子Fas、Bax、Bc1-2在mRNA水平和蛋白水平的表达量,发现促凋亡基因显著表达,而抑凋亡基因表达量明显减少。2、不同浓度的rBTI对MCF-7细胞进行处理后,运用Western Blot技术和qRT-PCR对NFκB/p65途径中p65、IκBα、IKKα/β在转录水平、翻译水平的表达量进行检测；通过免疫荧光技术检测p65的核转位,结果显示IKKa/p表达量显著升高、IκBα发生了明显的磷酸化,同时p65蛋白在细胞质内逐渐减少、在细胞核内逐渐增多。流式细胞术检测结果表明rBTI可促使ROS水平升高,当NAC将ROS抑制后,可从Western blot结果看出IκBα的磷酸化情况明显减小,NF-KB/p65核转位也相对减少。说明NF-KB/p65信号通路的激活与ROS的增加相关。由此可见,rBTⅠ可促进ROS的产生,IκBα的磷酸化降解,从而诱导p65蛋白的核转位,激活NF-κB/P65信号通路。综上所述,rBTI阻断MCF-7细胞周期进程,促进MCF-7细胞凋亡,可能是通过激活MCF-7细胞中NFKB/p65信号通路。3、rBTI和紫杉醇都具有抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确。本研究通过MTT比色法对rBTI与紫杉醇联合用药对MCF-7细胞增殖的影响进行检测；采用流式细胞术对MCF-7细胞的凋亡以及ROS水平进行检测；利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况。结果表明,rBTI(2.5μM)与紫杉醇(0.05-0.5μM)联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖。将rBTI与紫杉醇进行联合作用于MCF-7细胞,诱导了MCF-7细胞的凋亡及ROS的产生；同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/P65的核转位；与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和Cyclin D1的表达。本研究证实,rBTI联合紫杉醇可诱导ROS的产生,激活NFκB/P65信号通路,协同诱导MCF-7细胞的凋亡。以上研究结果为rBTI抗乳腺癌作用的研究奠定了基础,为乳腺癌的治疗和联合用药提供了新的策略。
【关键词】：重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 凋亡 活性氧 MCF-7细胞 核转录因子-κB
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 第一章 文献综述14-19
• 1.1 引言14
• 1.2 蛋白酶抑制剂14-15
• 1.2.1 蛋白酶抑制剂的结构与分类14
• 1.2.2 蛋白酶抑制剂的生物学功能14-15
• 1.3 NFκB信号通路研究进展15-18
• 1.3.1 NFκB信号通路概述15-18
• 1.3.2 NFκB信号通路在肿瘤细胞中的功能研究18
• 1.4 本论文的研究目的与意义18-19
• 第二章 rBTI对MCF-7细胞的作用研究19-30
• 2.1 引言19
• 2.2 实验材料与仪器19-20
• 2.2.1 细胞、材料及主要试剂19
• 2.2.2 主要实验仪器19-20
• 2.3 实验方法20-23
• 2.3.1 细胞培养20
• 2.3.2 MTT检测20-21
• 2.3.3 细胞周期检测21
• 2.3.4 细胞凋亡检测21
• 2.3.5 细胞线粒体膜电位检测(MMP,△Ψm)21
• 2.3.6 划痕擦伤实验检测MCF-7细胞迁移21-22
• 2.3.7 RNA的提取及cDNA的合成22
• 2.3.8 qRT-PCR检测基因的表达情况22
• 2.3.9 Western blot检测蛋白表达量22-23
• 2.3.10 统计学分析23
• 2.4 结果与分析23-28
• 2.4.1 rBTI可抑制MCF-7细胞的增殖23-24
• 2.4.2 rBTI可阻断MCF-7细胞的细胞周期24-25
• 2.4.3 rBTI可诱导MCF-7细胞凋亡25-26
• 2.4.4 rBTI可降低MCF-7细胞的线粒体膜电位26
• 2.4.5 rBTI可抑制MCF-7细胞迁移26-27
• 2.4.6 rBTI对细胞周期及凋亡基因表达的影响27-28
• 2.4.7 rBTI对细胞周期及凋亡蛋白表达的影响28
• 2.5 小结28-30
• 第三章 rBTI对MCF-7细胞NFKB信号通路的影响30-39
• 3.1 引言30
• 3.2 实验材料与仪器30-31
• 3.2.1 细胞、材料及主要试剂30
• 3.2.2 主要实验仪器30-31
• 3.3 实验方法31-32
• 3.3.1 细胞培养31
• 3.3.2 RNA的提取及cDNA的合成31
• 3.3.3 qRT-PCR检测细胞IKKα/β、IκBα基因表达31
• 3.3.4 Western blot检测蛋白的表达量31
• 3.3.5 荧光免疫技术检测NF-κB/p65蛋白的核转位31-32
• 3.3.6 流式细胞仪检测细胞ROS水平32
• 3.3.7 统计学分析32
• 3.4 结果与分析32-37
• 3.4.1 rBTI对NF-κB/p65蛋白在MCF-7细胞中分布的影响32
• 3.4.2 rBTI对NF-κB/p65蛋白核转位的影响32-35
• 3.4.3 rBTI下调IκBα的表达35
• 3.4.4 rBTI诱导MCF-7细胞中ROS的产生35-37
• 3.5 小结37-39
• 第四章 rBTI联合紫杉醇对MCF-7细胞的影响39-49
• 4.1 引言39
• 4.2 实验材料与仪器39-40
• 4.2.1 细胞、材料及主要试剂39
• 4.2.2 主要实验仪器39-40
• 4.3 实验方法40
• 4.3.1 细胞培养40
• 4.3.2 MTT检测40
• 4.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡40
• 4.3.4 流式细胞仪检测细胞ROS水平40
• 4.3.5 Western印迹检测相关蛋白的表达40
• 4.3.6 细胞总RNA提取及qRT-PCR40
• 4.4 结果与分析40-47
• 4.4.1 rBTI联合紫杉醇对MCF-7细胞增殖的影响40-42
• 4.4.2 流式细胞检测MCF-7细胞凋亡42-43
• 4.4.3 rBTI联合紫杉醇对凋亡相关因子的影响43
• 4.4.4 流式细胞检测细胞ROS水平43-45
• 4.4.5 rBTI联合紫杉醇对NFκB/p65信号通路的影响45-47
• 4.5 小结47-49
• 总结与展望49-51
• 参考文献51-56
• 攻读学位期间取得的研究成果56-57
• 致谢57-58
• 个人简介及联系方式58-59
• 承诺书59-60

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 周亿金;李文平;;蚯蚓抗氧化提取液抗氧化作用研究[J];动物医学进展;2009年06期

2 张洪长;王恩鹏;陈新;唐燕;王洪鑫;王炫策;许新;;人参皂苷Re对UVC辐射损伤细胞的保护作用[J];吉林大学学报(医学版);2013年03期

3 康伟祥;王振宇;陈思;陈卓;张丹;王建钧;汤银娟;;茶多酚干预紫外线辐射致雄性小鼠生殖系统损伤的实验研究[J];湘南学院学报(医学版);2015年01期

4 吕望;袁小帅;汪路明;王志田;韩威力;;miR-106a在食管鳞癌中的表达及对耐药基因的调控作用[J];海南医学院学报;2015年05期

5 郝银菊;马琳;李玉香;黄菱;赵莹;张玉玲;余建强;;氧化槐定碱对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J];时珍国医国药;2012年09期

6 傅梦月;胡倩;唐元元;姜苇;丁蓉蓉;唐雪;;植物甾醇对肉鸡肠道氧化还原状态的影响[J];食品工业科技;2013年04期

7 王恩鹏;陈新;许新;王洪鑫;张洪长;;人参三醇组皂苷对UVC照射引起的RSa细胞损伤保护作用的研究[J];时珍国医国药;2013年08期

8 李玉英;吴燕子;白崇智;崔晓东;王转花;;rBTI联合紫杉醇通过激活NFκB/p65促进MCF-7细胞凋亡[J];中国生物化学与分子生物学报;2014年08期

9 吴佳伶;钱和;汪何雅;成玉梁;杜超;;红酵母红素对氧化受损PC12细胞的保护作用[J];食品工业科技;2014年23期

10 朱文赫;张巍;秦迎新;沈楠;赵丽静;赵行宇;;胡桃楸青皮萃取物对内源性H_2O_2诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用研究[J];上海中医药杂志;2015年02期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 孙玮;;中西医结合治疗慢性疲劳综合症的优势性思考[A];第九次全国中西医结合基础理论研究学术研讨会论文汇编[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 苏莉;镍对雄性大鼠的生殖毒性及原花青素的保护作用研究[D];兰州大学;2011年

2 司晓青;芦丁抗紫外线照射所致皮肤光损伤的防护作用及其机制的研究[D];山东大学;2011年

3 陈军;梅山母猪日粮蛋白水平对仔猪生长发育、血清抗氧化酶活性的影响[D];南京农业大学;2011年

4 李晓泓;“逆灸”对佐剂性关节炎的影响及机制研究[D];北京中医药大学;2004年

5 芦惠;氧化应激、一氧化氮合酶及表皮生长因子在新生鼠肠损伤中的动态变化及机制研究[D];中国医科大学;2005年

6 杜海英;镉抗肿瘤作用及其相关机制的研究[D];吉林大学;2006年

7 胡建中;骨关节炎发病机理及治疗的系列研究[D];中南大学;2006年

8 王晓峰;从分子及细胞水平的改变研究经口摄入的Cr（Ⅵ）对小鼠的毒性效应[D];浙江大学;2007年

9 张黎;玉米幼芽提取物对皮肤氧化损伤的保护作用及其机制研究[D];西北农林科技大学;2007年

10 董丽霞;不同模式间歇低氧血管内皮损伤机制的研究[D];天津医科大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 杨丽;褐飞虱取食对水稻叶鞘维管束组织结构特征和胼胝质的影响[D];杭州师范大学;2013年

，

本文编号：1040963