结肠癌相关基因KPNA2的筛选验证及其作用机制研究

发布时间：2017-10-17 12:22

  本文关键词：结肠癌相关基因KPNA2的筛选验证及其作用机制研究

  更多相关文章： 结肠癌 KPNA2 诊断 预后

【摘要】：结肠癌是世界范围内的常见恶性肿瘤之一,在我国,结肠癌的发病率不断增加,已成为最常见的恶性肿瘤。目前,结肠癌的发病机制尚未阐明。细胞转运相关蛋白的功能异常可引起癌基因及抑癌基因的转运及定位功能异常,因此,细胞转运相关蛋白可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。本课题聚焦于核转运受体蛋白家族,通过Real-time PCR筛选该家族内与结肠癌相关的基因,经过Western blot验证,并采用免疫组织化学技术分析包含203例样品的结肠癌组织芯片,通过构建vsh RNA慢病毒载体抑制细胞中KPNA2的表达,体内和体外实验评估KPNA2表达下调后对结肠癌细胞恶性表型的影响。结果发现:40例结肠癌样品中,25例出现KPNA2的高表达,占总例数的62%;KPNA2在结肠癌组织中表达升高达5倍以上的例数有18例,占总数的45%,提示KPNA2作为结肠癌相关基因的可能性大;Western blot验证结果显示,大多数结肠癌组织中KPNA2的蛋白水平高于其对应的正常黏膜组织。组织芯片中KPNA2基因在结肠癌组织中的表达明显高于正常肠上皮组织,并且KPNA2基因的高表达可以作为结肠癌患者预后判断的独立影响因素。体外功能实验发现,KPNA2基因的下调可抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力;裸鼠成瘤实验发现,KPNA2基因的下调可以抑制结肠癌细胞的体内致瘤能力。本实验研究KPNA2基因在结肠癌中的表达模式及其在结肠癌发生发展中的作用,为KPNA2基因在临床诊断和治疗的应用提供了理论基础。第一部分五个候选癌基因在结肠癌组织中的表达目的:检测5个Karyopherins家族成员KPNA2、KPNA4、KPNA5、KPNA7及KPNB1在结肠癌组织中的表达,以筛选该家族中与结肠癌相关的基因。方法:Real-time PCR检测40对结肠癌组织及其配对的正常黏膜组织中5种基因的m RNA表达水平,并通过Wsetern blot分析验证KPNA2在配对组织样品中的蛋白表达情况。结果:1.40例样品中,25例出现KPNA2的高表达,占总例数的62%;16例出现KPNA4的高表达,占总例数的40%;10例表现出KPNA5高表达,占总例数的25%;KPNA7和KPNB1高表达的例数分别为13例和9例,各占总例数的32%和22%。此外,KPNA2在结肠癌组织中表达升高达5倍以上的例数有18例,占总数的45%。2.Western blot验证结果显示大多数结肠癌组织中KPNA2的蛋白水平高于其对应的正常黏膜组织。结论:KPNA2基因是在结肠癌中发挥主要作用的Karyopherins家族成员,其在结肠癌组织中的m RNA水平及蛋白水平均高于正常组织。第二部分结肠癌组织芯片中KPNA2的表达及预后判断价值的研究目的:免疫组织化学技术检测KPNA2在结肠癌组织芯片中的表达,并分析其与结肠癌患者临床病理特征的相关性。方法:免疫组织化学技术对203例结肠癌组织芯片进行染色,统计学方法分析KPNA2的表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性。结果:1.KPNA2在结肠癌组织中的表达高于其配对的正常黏膜组织,两者具有统计学差异;KPNA2基因的高表达与结肠癌的AJCC分期、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、远处转移、分化程度及Ki-67的表达显著相关。2.KPNA2基因高表达患者的5年无病生存率和总体生存率明显低于KPNA2低表达患者;KPNA2基因的高表达可以作为结肠癌患者预后判断的独立影响因素。结论:KPNA2基因是结肠癌预后的独立诊断因素,可能与结肠癌的发生发展相关。第三部分KPNA2在结肠癌恶变进程中的生物学功能研究目的:构建KPNA2表达水平下调的结肠癌细胞模型,以进一步探讨KPNA2基因对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:运用vshRNA慢病毒载体抑制细胞中KPNA2基因的表达,构建RKO和HCT116两种KPNA2表达下调的结肠癌细胞株;通过CCK-8、平板克隆、Transwell小室和裸鼠成瘤实验,研究KPNA2表达下调后对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响。结果:1.构建4个RNAi慢病毒载体候选靶点,并通过Real-time PCR和Western blot外源筛选出KPNA2-RNAi(23866-1)靶点对KPNA2基因敲减效率最显著,为有效靶点。2.Real time PCR和Western blot验证由vshRNA慢病毒载体构建的KPNA2表达下调的结肠癌细胞中,KPNA2基因的敲减效率达70%以上,提示KPNA2表达下调的结肠癌细胞株构建成功。3.体外功能实验结果显示:采用CCK-8检测各组细胞活性,发现培养48、72小时后,KPNA2基因敲减细胞的活性较其对照组明显下降;克隆形成实验结果显示KPNA2基因敲减细胞的克隆形成能力较对照组明显下降。Transwell迁移实验中,KPNA2基因敲减组穿过滤膜的细胞数明显少于对照组。4.裸鼠成瘤实验发现KPNA2基因的表达下调可以有效减弱结肠癌细胞的体内致瘤能力。结论:KPNA2基因表达下调后结肠癌细胞的增殖、克隆形成、迁移及裸鼠成瘤能力显著降低。提示KPNA2基因表达下调可引起结肠癌细胞的恶性程度降低。
【关键词】：结肠癌 KPNA2 诊断 预后
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 中英文名词对照14-16
• 绪论16-18
• 第一部分 五个候选癌基因在结肠癌组织中的表达18-34
• 1.引言18
• 2.材料和方法18-26
• 3.结果26-30
• 4.讨论30-34
• 第二部分 结肠癌组织芯片中KPNA2的表达及预后判断价值的研究34-48
• 1.引言34
• 2.材料和方法34-40
• 3.结果40-46
• 4.讨论46-48
• 第三部分 KPNA2在结肠癌恶变进程中的生物学功能研究48-81
• 1.引言48
• 2.材料和方法48-66
• 3.结果66-79
• 4.讨论79-81
• 全文总结81-82
• 参考文献82-87
• 致谢87-89
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文情况与参研项目89

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本文编号：1048827