砷通过诱导HepG2细胞线粒体自噬抑制细胞增殖的机制研究

发布时间：2017-10-18 21:06

  本文关键词：砷通过诱导HepG2细胞线粒体自噬抑制细胞增殖的机制研究

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【摘要】：肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见且恶性程度最高的肿瘤之一。目前的治疗手段主要依靠化学疗法,然而可用药物种类有限,治疗过程中易产生耐药性,作用机理研究不完善等因素在很大程度上限制着HCC的疗效。自三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)成功地应用于治疗急性早幼粒白血病以来,其在临床治疗多种实体瘤中所展现的作用引起了国内外学者的极大兴趣。近年来研究发现,As2O3能通过减少血管再生、抑制细胞增殖、降低细胞侵袭转移风险、诱导细胞凋亡和自噬等途径对肝癌起到一定的治疗作用。其中,抑制细胞增殖是As203致肝癌细胞毒性的最基本作用途径。线粒体作为真核细胞内的重要细胞器,其结构、功能、数量的改变在调控肿瘤细胞增殖方面具有多重作用,同时它也是砷发挥毒性作用的主要靶位点,而As2O3能否通过线粒体途径来抑制细胞增殖及其可能的作用机制目前尚未可知。本研究以人肝癌细胞HepG2为实验材料,通过MTT法、细胞克隆形成分析、实时荧光定量PCR、透射电镜观察、蛋白免疫印迹、细胞免疫荧光、荧光染色原位标记等技术手段,探究As203对细胞增殖及线粒体自噬各时期典型事件的影响,结合特异性线粒体自噬抑制剂,环孢霉素A (cycbsporin, CsA)和线粒体分裂抑制剂-1 (mitochondrial division inhibitor-1, Mdivi-1)的使用,及对细胞增殖诱导型酶,环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)作用机制的研究,阐明As203通过诱导线粒体自噬途径对细胞增殖的抑制效应及相关机制。以期为临床使用As203作为抗肿瘤药物提供相关研究背景及毒理学依据。研究结果显示：1.As2O3 (2、4、8μM)暴露12、24、36 h后,细胞活力呈浓度、时间依赖性降低(P0.05),表明本研究所用剂量、时间范围内的As203己对HepG2细胞产生毒性作用；2.不同浓度As203处理细胞相同时间或相同浓度(4 μM)As2O3处理细胞不同时间后,细胞生长速度、细胞克隆形成能力以及细胞增殖活性(细胞增殖活性标记物Ki-67 mRNA表达量)均随着浓度的升高或时间的延长而降低(P0.05),但各处理组中均未发生细胞凋亡(P0.05),表明本研究所用As203作用剂量、时间范围内,HepG-2细胞增殖呈浓度、时间依赖性降低且与细胞凋亡无关；3.4μM As2O3处理细胞12、24 h后,诱导细胞内形成线粒体自噬体及线粒体自噬溶酶体；进一步研究发现,As2O3暴露后线粒体自噬相关蛋白PINK1的蓄积量和LC3 Ⅰ型向Ⅱ型的转化率呈浓度、时间依赖性升高(P0.05),同时线粒体与溶酶体焦点增多；相反,线粒体内膜蛋白COXⅣ表达量呈浓度、时间依赖性降低(P0.05),表明在本研究所用暴露浓度、时间范围内,As2O3诱导3epG2细胞发生线粒体自噬,且发生程度呈浓度、时间依赖性加强,导致线粒体总量随之减少；4.与4 μMAs2O3单独处理组相比,线粒体自噬抑制剂CsA(5 μM)/Mdivi-1(15 μM)预处理细胞2h后,PINK1蓄积量和LC3Ⅱ/Ⅰ比率降低,COX Ⅳ表达量升高,表明As2O3诱导的线粒体自噬受到抑制(P0.05)；与此同时,Ki-67mRNA表达量升高(P0.05),说明在As2O3胁迫下,线粒体自噬发生从而抑制细胞增殖；5.As2O3暴露后,COX-2蛋白和mRNA表达水平均降低(P0.05)；COX-2抑制剂NS398(100 μM)单独处理细胞后,Ki-67 mRNA表达量极显著地降低(P0.01),进一步证明了COX-2在As2O3抑制细胞增殖的过程中起重要的正向调控作用；6.与As2O3单独处理组相比,在CsA/Mdivi-1预处理组中COX-2蛋白水平显著恢复(P0.05),说明线粒体自噬能够减少COX-2蛋白在细胞内的富集；通过荧光共聚焦显微镜观测显示COX-2主要定位于线粒体外膜,只有少部分分布在细胞质中,As2O3暴露后,线粒体外膜及细胞质中的COX-2蛋白水平均减少；CsA预处理后,两部分的COX-2蛋白水平显著增加并超过相应对照组的水平,与之相反Mdivi-1预处理后,线粒体上的COX-2蛋白水平减少,细胞质中的无明显变化；COX-2 mRNA表达量在CsA/Mdivi-1预处理组较As2O3单独处理组极显著升高(P0.01)；结合两种线粒体自噬抑制剂的作用机理,以上结果表明大量位于线粒体上的COX-2随着特异性地线粒体自噬性降解而被降解,同时线粒体自噬的发生还可抑制COX-2的转录翻译过程。综上所述,本研究表明,As2O3通过诱导HepG2细胞发生线粒体自噬,降低细胞内COX-2蛋白水平,从而抑制HepG2细胞增殖。在此过程中伴随着线粒体特异性的自噬性清除,定位于线粒体上的COX-2也随之降解,且线粒体自噬对COX-2的表达过程具有抑制作用。
【关键词】：三氧化二砷 细胞增殖 线粒体自噬 环氧合酶-2 HepG2
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 前言11-22
• 1.1 肝癌11-12
• 1.2 三氧化二砷12-14
• 1.2.1 三氧化二砷简介12
• 1.2.2 三氧化二砷在肿瘤治疗方面的研究进展12-14
• 1.3 线粒体14-15
• 1.3.1 线粒体简介14
• 1.3.2 线粒体是砷发挥细胞毒性的重要靶位点14-15
• 1.4 线粒体自噬15-18
• 1.4.1 自噬与线粒体自噬15-16
• 1.4.2 PINK1-Parkin信号通路介导的线粒体自噬分子途径16-17
• 1.4.3 线粒体自噬与细胞增殖17-18
• 1.5 环氧合酶-218-20
• 1.5.1 环氧合酶-2概述18
• 1.5.2 环氧合酶-2调控细胞增殖18-19
• 1.5.3 环氧合酶2与线粒体自噬19-20
• 1.6 研究目的及意义20
• 1.7 实验技术路线20-22
• 第二章 实验材料与方法22-39
• 2.1 实验材料22
• 2.2 主要试剂与仪器22-27
• 2.2.1 主要试剂22-23
• 2.2.2 主要仪器23-24
• 2.2.3 主要溶液配制24-27
• 2.3 实验方法27-38
• 2.3.1 细胞培养27-28
• 2.3.2 细胞活力检测28-29
• 2.3.3 细胞生长曲线检测以及绘制29
• 2.3.4 细胞克隆形成分析29
• 2.3.5 RNA的提取29-31
• 2.3.6 实时定量PCR检测Ki-67及COX-2 mRNA表达量31-33
• 2.3.7 AV/PI检测细胞凋亡33-34
• 2.3.8 透射电镜检测细胞内线粒体自噬体的产生34
• 2.3.9 蛋白提取及定量34-36
• 2.3.10 蛋白免疫印迹实验36-37
• 2.3.11 细胞免疫荧光实验37-38
• 2.3.12 MTG/LTR双染示踪线粒体自噬体38
• 2.4 统计学分析38-39
• 第三章 研究结果39-53
• 3.1 As_2O_3对细胞活力的影响39-40
• 3.2 As_2O_3对细胞增殖以及凋亡的影响40-43
• 3.2.1 As_2O_3对细胞生长曲线的影响40
• 3.2.2 AS_2O_3对细胞克隆形成能力的影响40
• 3.2.3 As_2O_3对Ki-67 mRNA表达量的影响40-42
• 3.2.4 As_2O_3对细胞凋亡的影响42-43
• 3.3 As_2O_3对线粒体自噬的影响43-48
• 3.3.1 As_2O_3诱导线粒体自噬体产生43
• 3.3.2 As_2O_3诱导线粒体自噬相关蛋白PINK1蓄积43-44
• 3.3.3 As_2O_3诱导LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化44-46
• 3.3.4 As_2O_3诱导线粒体通过自噬途径降解46-48
• 3.4 抑制线粒体自噬对细胞增殖的影响48-49
• 3.5 COX-2介导线粒体自噬对细胞增殖的抑制作用49-53
• 3.5.1 COX-2参与As_2O_3抑增殖作用49-51
• 3.5.2 抑制线粒体自噬增加COX-2表达量51-53
• 第四章 讨论53-58
• 4.1 As_2O_3对细胞增殖的影响53
• 4.2 As_2O_3诱导线粒体自噬发生及其对细胞增殖的影响作用53-56
• 4.3 COX-2介导As_2O_3通过线粒体自噬途径抑制细胞增殖56-58
• 第五章 结论58-59
• 5.1 主要结论58
• 5.2 研究展望58-59
• 附录59-61
• 附录Ⅰ：qPCR扩增曲线、标准曲线及溶解曲线59-60
• 附录Ⅱ：主要缩略词60-61
• 参考文献61-69
• 在学期间的研究成果69-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：1057131