Amygdalin对抗谷氨酰胺剥夺诱导的肝癌细胞HepG2凋亡及其抗氧化机制的研究

发布时间：2017-10-19 02:17

  本文关键词：Amygdalin对抗谷氨酰胺剥夺诱导的肝癌细胞HepG2凋亡及其抗氧化机制的研究

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【摘要】：Amygdalin作为天然药物，具有丰富的药用价值特别是具有抗肿瘤的功效，但Amygdalin抗氧化的生物学作用研究尚未见有报道，本文首次用生物学实验证明了Amygdalin的抗氧化作用。剥夺谷氨酰胺可以使HepG2细胞内活性氧（ROS）堆积，从而导致细胞凋亡。Amygdalin在小剂量的条件下可以降低HepG2细胞内谷氨酰胺引起的ROS的堆积，通过其抗氧化作用对抗HepG2剥夺谷氨酰胺导致的细胞凋亡，而大剂量的Amygdalin无此作用。 通过MTT实验检测HepG2细胞在无谷氨酰胺的DMEM培养时加入不同剂量Amygdalin对细胞活力的影响，AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪检测无谷氨酰胺时，Amygdalin对细胞凋亡的影响，RT-PCR进一步检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA水平的表达。结果表明无谷氨酰胺时细胞的活力降低，凋亡比率增加，Bax/Bcl-2比值增加。而加入0.5mg/ml Amygdalin后细胞的活力增加，凋亡比率降低，Bax/Bcl-2比值降低，但5mg/mlAmygdalin与无谷氨酰胺组相比活力降低，Bax/Bcl-2比值增加。Amygdalin在0.5mg/ml的剂量可以对抗谷氨酰胺剥夺导致的HepG2细胞凋亡，，而5mg/mlAmygdalin无此作用。 为探讨Amygdalin对抗谷氨酰胺剥夺导致的HepG2细胞凋亡机制我们又进行了如下实验：有无谷氨酰胺时Amygdalin对HepG2细胞内羟自由基的影响；DCFH-DA探针检测，荧光显微镜观察和流式细胞仪检测无谷氨酰胺时Amygdalin对HepG2细胞内ROS的影响；RT-PCR和Western blot检测无谷氨酰胺时Amygdalin对HepG2细胞内抗氧化酶mRNA和蛋白水平的影响并进一步检测酶活力。通过实验证明0.5mg/mlAmygdalin可以降低谷氨酰胺引起的细胞内的ROS而对抗细胞凋亡，而大剂量的Amygdalin则无此作用。无谷氨酰胺时，0.5mg/ml Amygdalin可以上调HepG2细胞内抗氧化酶SOD1和CAT mRNA和蛋白水平和CAT酶活力，加入CAT的抑制剂ATM后，Amygdalin对抗Gln剥夺诱导的HepG2细胞凋亡作用消失。 Amygdalin分子由一单元苯甲醛，一单元氢氰酸和两单元葡萄糖组成，其分解产物苯甲醛及进一步氧化的产物苯甲酸具有抗氧化的化学结构，这可能是Amygdalin抗氧化的另一个潜在机制。我们在无细胞体系中用Amygdalin，Amygdalin和β-葡萄糖苷酶共同孵育，苯甲醛和苯甲酸进行了羟自由基生成试验。研究发现Amygdalin本身和苯甲醛不能抑制羟自由基的生成，在细胞内Amygdalin是否可以通过其分解产物苯甲酸发挥抗氧化机制有待进一步研究。
【关键词】：Amygdalin 抗氧化 谷氨酰胺 活性氧 凋亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写词表11-12
• 第1章 绪论12-24
• 1.1 Amygdalin 及其生物学作用12-19
• 1.1.1 Amygdalin 的分解12-13
• 1.1.2 Amygdalin 分解产物的毒性13
• 1.1.3 Amygdalin 的药理学作用13-15
• 1.1.4 Amygdalin 抗肿瘤作用的争议15-17
• 1.1.5 Amygdalin 的抗肿瘤作用17-19
• 1.2 活性氧与肿瘤19-22
• 1.2.1 活性氧的产生及生理作用19-20
• 1.2.2 活性氧与肿瘤的发生发展20-21
• 1.2.3 活性氧与肿瘤细胞凋亡21-22
• 1.3 谷氨酰胺与肿瘤22-23
• 1.3.1 谷氨酰胺及其生理功能22
• 1.3.2 谷氨酰胺与肿瘤22-23
• 1.4 抗氧化与肿瘤23-24
• 第2章 Amygdalin 对抗谷氨酰胺(Gln)剥夺诱导的肝癌细胞HepG2 凋亡及其机制的研究24-38
• 2.1 实验器材24-26
• 2.1.1 主要仪器24-25
• 2.1.2 主要试剂配制25-26
• 2.1.3 细胞株来源26
• 2.2 实验方法26-37
• 2.2.1 细胞培养26
• 2.2.2 MTT 检测 Amygdalin 对有无 Gln 的培养液培养的HepG2 细胞的毒性作用26-27
• 2.2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI 双染检测 Amygdalin 对 HepG2 的凋亡的影响27-28
• 2.2.4 羟自由基检测28-29
• 2.2.5 超氧化物歧化酶活力的测定29-31
• 2.2.6 过氧化氢酶（CAT）活力的测定31-32
• 2.2.7 细胞 ROS 水平检测32-33
• 2.2.8 RT-PCR33-35
• 2.2.9 Westrn blot 检测蛋白表达水平35-37
• 2.3 统计学处理37-38
• 第3章 实验结果38-55
• 3.1 Amygdalin 对抗谷氨酰胺(Gln)剥夺诱导的肝癌细胞HepG2 凋亡的研究38-41
• 3.1.1 MTT 检测无 Gln 时 Amygdalin 对 HepG2 细胞活力的影响38
• 3.1.2 AnnexinⅤ-FITC/PI 双染检测无 Gln 时 Amygdalin 对HepG2 细胞凋亡的影响38-39
• 3.1.3 RT-PCR 检测无 Gln 时 Amygdalin 对 HepG2 细胞内Bax 和 Bcl-2 mRNA 水平的影响39-41
• 3.2 Amygdalin 对抗谷氨酰胺(Gln)剥夺诱导的肝癌细胞HepG2 凋亡机制的研究41-44
• 3.2.1 Amygdalin 在细胞内的抗氧化作用41-44
• 3.3 Amygdalin 对 HepG2 细胞内抗氧化酶的影响44-52
• 3.3.1 RT-PCR 检测无 Gln 时 Amygdalin 对 HepG2 细胞内抗氧化酶 mRNA 水平的影响44-46
• 3.3.2 Western Blot 检测无 Gln 时 Amygdalin 对 HepG2 细胞内抗氧化酶蛋白水平的影响46-49
• 3.3.3 检测无 Gln 时 Amygdalin 对 HepG2 细胞内抗氧化酶SOD 和 CAT 酶活力的影响49-50
• 3.3.4 加入 CAT 抑制剂 3-氨基-1.2.4-三唑（ATM）检测无 Gln 时 Amygdalin 对HepG2 细胞凋亡的影响50-52
• 3.4 Amygdalin 的体外抗氧化分析52-55
• 3.4.1 检测 Amygdalin 对羟自由基生成的影响52-53
• 3.4.2 检测 Amygdalin 和β-葡萄糖苷酶共同孵育后对羟自由基生成的影响53
• 3.4.3 检测苯甲醛和苯甲酸对羟自由基生成的影响53-55
• 第4章 讨论55-58
• 第5章 结论58-59
• 参考文献59-64
• 个人简介64-65
• 致谢65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李龙秀;韩春梅;;苯甲酸对萝卜种子萌发及抗氧化酶活性的影响[J];园艺与种苗;2011年02期

2 董捷;尹策;张红城;李春阳;陈翠丽;;杏花花粉中苦杏仁苷的抗氧化性研究[J];食品科学;2007年08期

本文编号：1058471