sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-10-20 06:19

  本文关键词：sTRAIL蛋白原核表达载体的构建、表达及抗肿瘤活性研究

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【摘要】：肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族中新发现的一员,是人体内正常表达的一种蛋白分子。TRAIL蛋白能特异的与某些肿瘤细胞表面的凋亡受体结合,从而诱导肿瘤细胞凋亡,且不诱导正常细胞和组织凋亡,也不像已发现的细胞凋亡因子TNF-α会产生严重的炎症反应。TRAIL蛋白这一关键特性的发现,使其成为目前肿瘤治疗研究中的热点。完整的TRAIL蛋白含有281个氨基酸残基,但其完整的蛋白分子在原核细胞中可溶性低,限制了其的应用。但TRAIL蛋白分子的114-281位氨基酸片段(soluble TRAIL,sTRAIL)在原核表达中的可溶性大大提高,且保持了活性。利用微生物作为宿主表达抗肿瘤外源蛋白,原因在于大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、表达量较高,利于发酵制备物的提取、纯化、控制等优点,研究工作日益受到重视。本研究通过培养人早幼粒白细胞HL-60细胞,提取总RNA,通过RT-PCR扩增sTRAIL蛋白基因片段,构建了重组质粒pET28a-sTrail。鉴定成功以及测序正确后电击转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导成功表达sTRAIL蛋白。经过对诱导温度,诱导转速以及IPTG浓度的优化,确定了在16℃、IPTG浓度为0.1mM、诱导时间12 h的诱导条件下可溶蛋白含量最高。通过优化Ni-IDA层析柱纯化重组蛋白条件,SDS-PAGE蛋白电泳以及胶内酶解质谱鉴定,确定纯化收集的蛋白为sTRAIL蛋白。纯化后的sTRAIL蛋白对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人子宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(Hep-3B)、人结肠癌细胞(HCT-116)和人大细胞肺癌细胞(H460)等肿瘤细胞有良好的抑制效果,通过MTT法检测,在sTRAIL蛋白浓度为1200 ng/mL,作用48 h后,对上述细胞的抑制率分别为32.9%、27.2%、29.7%、22.5%和10.8%,存在浓度依赖性。从倒置相差显微镜观察发现,越来越多的肿瘤细胞从梭形或不规则形态转变为圆形,且细胞变厚,透光率发生变化。同时sTRAIL蛋白对正常的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)未发现细胞毒性。本研究对sTrail重组基因的克隆,sTRAIL蛋白表达、纯化以及抗肿瘤活性进行了研究。sTRAIL蛋白所具有良好的抗肿瘤生物活性,且对正常细胞无害,有望成为新型的能在临床抗肿瘤的药物分子。本研究为sTRAIL蛋白的潜在开发应用提供了新的实验依据。
【关键词】：肿瘤坏死因子相关凋亡配体 基因克隆 原核表达 蛋白纯化 抗肿瘤活性
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 引言11-24
• 1 TRAIL与肿瘤治疗11-21
• 1.1 TRAIL的结构11-13
• 1.2 TRAIL的受体种类13-16
• 1.3 TRAIL诱导凋亡的机制16-17
• 1.4 TRAIL诱导凋亡的调控17-21
• 1.5 TRAIL的其他生物活性21
• 2 抗肿瘤蛋白的研究进展21-24
• 2.1 微生物、真菌抗肿瘤蛋白21-22
• 2.2 动物、植物抗肿瘤蛋白22-24
• 第二章 材料与方法24-36
• 1 材料24-29
• 1.1 菌株与质粒24
• 1.2 引物24
• 1.3 培养基和抗生素24-25
• 1.4 主要试剂25-28
• 1.5 仪器与设备28
• 1.6 细胞株28-29
• 2 方法29-36
• 2.1 sTrail基因的获取29-31
• 2.2 表达载体pET28a-sTrail的构建及检测31-32
• 2.3 重组质粒转化E. coli BL21（DE3）32-33
• 2.4 E. coli BL21（DE3）（p ET28a-sTrail）中sTRAIL的诱导表达33
• 2.5 重组菌株中s TRAIL的SDS-PAGE检测33
• 2.6 sTRAIL的质谱鉴定33-34
• 2.7 sTRAIL蛋白的收集纯化34
• 2.8 细胞培养、增殖与传代34-35
• 2.9 sTRAIL蛋白的抗肿瘤活性检测35-36
• 第三章 结果与分析36-43
• 1 sTrail基因的获取36-37
• 1.1 HL-60细胞中总RNA的提取36
• 1.2 sTrail基因的扩增36-37
• 2 构建诱导表达载体p ET28a-sTrail的鉴定37-38
• 3 sTRAIL蛋白的表达与检测38-40
• 4 sTRAIL蛋白的纯化与定量40-41
• 5 sTRAIL蛋白的抗肿瘤活性检测41-43
• 第四章 讨论43-46
• 1 sTRAIL蛋白异源表达系统的选择43
• 2 sTRAIL蛋白诱导和纯化条件的优化43-45
• 3 sTRAIL蛋白抗肿瘤活性的分析45-46
• 结论与展望46-47
• 参考文献47-53
• 缩略语表53-54
• 论文发表情况54-55
• 项目资助情况55-56
• 致谢56

【共引文献】

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7 张培影;白花蛇舌草对宫颈癌细胞增殖、凋亡和Ki-67mRNA影响的实验研究[D];南京中医药大学;2010年

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