去泛素化酶USP27x在细胞中的分子功能及与肿瘤的关系

发布时间：2017-10-20 07:19

  本文关键词：去泛素化酶USP27x在细胞中的分子功能及与肿瘤的关系

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【摘要】：去泛素化酶(deubiquitinating enzymes, DUBs)通过水解泛素羧基末端的肽键、异肽键或者酯键,将泛素小分子特异性地从靶蛋白或前体蛋白上水解下来,以保护靶蛋白不通过泛素-蛋白酶体途径降解。USP27x (Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase 27)是去泛素化酶中USP家族的一员,开放阅读框具有1317bp,编码438个氨基酸,具有一个USP活性催化域。生物信息学分析表明USP27X与同家族的USP22氨基酸序列具有82%的一致性,但至今对USP27x的研究非常少,其生化特征和生物学功能仍然不清楚。本课题研究发现USP27x在人体各组织中都有表达,其中肝脏、胰腺表达量为最高,肺、乳腺中表达量较低。免疫组化和免疫荧光的结果表明USP27x主要定位于细胞质,但是与其高度同源的USP22却定位于细胞核。USP27x与USP22在细胞内定位上的明显差异,表明USP27x在细胞内可能具有不同于USP22的分子功能。为了明确USP27x是否对其它分子具有调控的能力,我们首先在体外明确USP27x为具有功能活性的去泛素化酶,然后通过在细胞内过表达USP27x,筛查细胞内蛋白分子的变化,发现USP27x的增加可导致p21蛋白表达量的增加,而这种增加在使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后消失,表明USP27x能通过蛋白酶体途径影响p21的蛋白水平。USP27x对p21的调控能力,促使我们推测USP27x可能介导了肿瘤细胞的恶性生物学行为。为了明确这种作用,我们通过克隆形成实验和MTT实验发现过表达USP27x可促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖。通过细胞周期实验发现,过表达USP27x导致细胞周期G1期减少,S期增加,促进细胞周期G1期向S期的转换。本研究初步揭示了去泛素化酶USP27x的生化特征、在细胞中的分子功能以及与肿瘤的关系,为进一步深入研究USP27x在细胞中的功能作用,揭示其介导肿瘤增殖的分子机制奠定了基础。
【关键词】：肿瘤 USP27x 去泛素化酶 亚细胞定位
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 中英文缩写对照8-13
• 第一章 绪论13-22
• 1.1 泛素-蛋白酶体途径13-16
• 1.1.1 泛素14
• 1.1.2 泛素活化酶(E1)14
• 1.1.3 泛素结合酶(E2)14-15
• 1.1.4 泛素-蛋白连接酶(E3)15
• 1.1.5 26S蛋白酶体15-16
• 1.2 去泛素化16-20
• 1.2.1 去泛素化酶的分类16-19
• 1.2.2 去泛素化酶的功能19-20
• 1.3 本课题的研究目的、内容和意义20-22
• 第2章 USP27x蛋白的序列分析及在细胞内的表达与定位22-41
• 2.1 前言22
• 2.2 实验材料与实验仪器22-24
• 2.2.1 实验试剂与耗材22-23
• 2.2.2 实验仪器与设备23-24
• 2.3 实验方法24-34
• 2.3.1 序列分析24
• 2.3.2 试剂配制24-25
• 2.3.3 细胞培养25-26
• 2.3.4 质粒pCMV-tag2b-3xFlag-USP27x的构建26-31
• 2.3.5 质粒的表达31
• 2.3.6 蛋白质检测31-33
• 2.3.7 免疫荧光(Immunofluorescence,IF)33
• 2.3.8 免疫组化33-34
• 2.4 实验结果34-40
• 2.4.1 USP27x的序列分析34-36
• 2.4.2 Flag-USP27x表达质粒的构建36
• 2.4.3 USP27x和USP22抗体特异性检测36-37
• 2.4.4 USP27x和USP22亚细胞定位37-39
• 2.4.5 USP27x在不同组织中的表达39-40
• 2.5 小结与讨论40-41
• 第3章 USP27x去泛素化酶活性及调控分子的鉴定41-53
• 3.1 前言41-42
• 3.2 实验材料与实验仪器42
• 3.2.1 实验试剂与耗材42
• 3.2.2 实验仪器与设备42
• 3.3 实验方法42-48
• 3.3.1 试剂配制42-43
• 3.3.2 质粒pCold Ⅱ-USP27x的构建43-46
• 3.3.3 重组质粒的原核表达与蛋白纯化46-47
• 3.3.4 去泛素化酶活性验证47-48
• 3.3.5 考马斯亮蓝的染色,检测USP27x的表达48
• 3.3.6 抗体筛选USP27x底物48
• 3.4 实验结果48-52
• 3.4.1 pCold Ⅱ-USP27x表达质粒的构建48-49
• 3.4.2 USP27x重组质粒在大肠杆菌中的蛋白表达49-50
• 3.4.3 USP27x去泛素化酶活性分析50-51
• 3.4.4 USP27x在细胞内调控分子的筛选51-52
• 3.4.5 USP27x通过蛋白酶体途径调控p2152
• 3.5 小结与讨论52-53
• 第4章 USP27x的生物学功能53-59
• 4.1 前言53
• 4.2 实验材料53-54
• 4.2.1 实验试剂与耗材53
• 4.2.2 实验仪器与设备53-54
• 4.3 实验方法54-56
• 4.3.1 所需试剂的配制54
• 4.3.2 细胞增殖实验54-55
• 4.3.3 细胞周期实验55-56
• 4.4 实验结果56-57
• 4.4.1 USP27x促进细胞周期由G0/G1期向S期转换56
• 4.4.2 USP27x促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖56-57
• 4.5 小结与讨论57-59
• 结论和展望59-60
• 1 结论59
• 2 展望59-60
• 参考文献60-65
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录65-66
• 致谢66-67

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本文编号：1065981