生物钟蛋白Cry1与肿瘤的关联性
发布时间：2017-10-23 05:05
本文关键词：生物钟蛋白Cry1与肿瘤的关联性
【摘要】：目的:检测生物钟蛋白Cry1在不同肿瘤组织中的表达并分析其与临床病理特征的关系,探讨Cry1与不同肿瘤发生发展的关系并筛选出与Cry1表达高度关联的肿瘤。体外培养肿瘤细胞,检测Cry1在肿瘤细胞中的表达和亚细胞定位。通过分子生物学手段改变肿瘤细胞Cry1的表达水平,检测细胞的增殖、凋亡和迁移的变化,探讨Cry1在该肿瘤发生发展中的作用。方法:(1)免疫组织化学法检测10种肿瘤(282例标本)中Cry1的表达,分析Cry1的表达与临床病理特征的关系,筛选出与Cry1表达高度关联的肿瘤组织。(2)培养正常肾小管上皮细胞HK-2和肾癌细胞786-0,分别提取细胞中的总RNA和总蛋白,Real time PCR和Western blot检测Cry1在不同细胞中的表达水平;构建Cry1真核表达载体pcDNA3.1(+)-Cry1,采用阳离子脂质体转染肾癌细胞786-0,转染48 h后收集细胞,Real time PCR和Western blot法检测786-0细胞中Cry1的表达,鉴定pcDNA3.1(+)-Cry1的功能;CCK-8检测细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,划痕试验检测细胞迁移的变化。(3)培养正常人胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞BGC-823,细胞免疫荧光法检测Cry1在GES-1和BGC-823细胞中的亚细胞定位;核质分离试剂盒分别提取GES-1和BGC-823细胞中的胞质蛋白和核蛋白,Western blot检测Cry1在细胞质和细胞核中的表达量。结果:第一部分:(1)生物钟蛋白Cry1在肾癌和宫颈癌组织中的表达强度低于癌旁组织,两者之间的差异有统计学意义(p㩳0.05);食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌等8种肿瘤的癌组织和癌旁组织之间,cry1表达强度的差异无统计学意义(p㧐0.05)。(2)cry1在细胞核和细胞质中均有表达,在多数肿瘤的癌旁组织中,cry1主要以细胞核表达为主,但在食管癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌等7种癌组织中,cry1的胞质表达水平较癌旁组织显著上升(p㩳0.05);在食管癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、肾癌、宫颈癌等6种癌组织中,cry1的核表达水平较癌旁组织显著下降(p㩳0.05);肝癌、胰腺癌和肾癌的癌组织和癌旁组织中,cry1的亚细胞定位在两者之间无统计学差异(p㧐0.05),其中在肝癌的癌组织和癌旁组织中,cry1胞质表达的比例均较高。(3)cry1在10种肿瘤组织中的表达及亚细胞定位与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度、tnm分期和淋巴结转移状态等临床病理特征均无相关性(p㧐0.05)。第二部分:(1)realtimepcr结果显示,cry1在肾癌细胞786-0,正常肾小管上皮细胞hk-2中均有表达,与正常对照hk-2细胞相比,cry1的转录水平在786-0细胞中偏低。westernblot检测结果表明cry1蛋白水平与基因转录水平结果基本一致。(2)使用构建的真核表达载体pcdna3.1(+)-cry1以及对照空质粒转染786-0细胞,48h后收集细胞,pcr结果显示,与对照质粒转染组细胞相比,转染pcdna3.1(+)-cry1的786-0细胞中cry1mrna的表达水平增加近45倍。(3)转染48h后,分别进行细胞增殖能力、细胞凋亡和迁移能力的检测,结果表明,转染pcdna3.1(+)-cry1的786-0细胞与对照质粒转染组细胞相比,细胞增殖、凋亡和迁移能力无明显改变。第三部分:(1)通过细胞免疫荧光检测发现,在胃癌细胞BGC-823中,Cry1在细胞核和细胞质均有表达,而在正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,Cry1主要表达在细胞核,胞质表达水平极低。(2)分别提取BGC-823细胞、GES-1细胞的核蛋白和胞质蛋白进行Western blot检测,检测结果与细胞免疫荧光结果基本一致。结论:1在肾癌和宫颈癌组织中,Cry1的表达低于癌旁组织,提示Cry1与肾癌和宫颈癌的发生呈负相关,可能对肾癌和宫颈癌具有抑制作用。2在食管癌、胃癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌等7种癌组织中,Cry1表达的亚细胞定位发生改变,提示Cry1的亚细胞定位发生改变可能与肿瘤的发生发展存在一定的关联。3增加Cry1的表达对于肾癌细胞786-0的增殖、凋亡和迁移等生物学行为无明显作用,提示Cry1可能与一些肿瘤相关蛋白共同作用对肾癌细胞生物学行为产生影响。
【关键词】：生物钟蛋白 Cry1 肿瘤
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：
- 中英文缩略词对照表5-9
- 中文摘要9-12
- Abstract12-16
- 前言16-18
- 第一部分：生物钟蛋白Cry1在不同肿瘤中的表达及其与临床病理特征的关系18-55
- 材料与方法18-21
- 1 材料与试剂18
- 2 主要实验设备和仪器18-19
- 3 实验方法和步骤19-21
- 结果21-46
- 讨论46-50
- 结论50-51
- 参考文献51-55
- 第二部分：生物钟蛋白Cry1在肾癌细胞中的表达及其对肾癌细胞生物学行为的影响55-91
- 材料与方法55-79
- 1 材料与试剂55-59
- 2 实验设备和仪器59-60
- 3 实验方法和步骤60-79
- 结果79-86
- 讨论86-89
- 结论89-90
- 参考文献90-91
- 第三部分：生物钟蛋白Cry1在胃癌细胞中的亚细胞定位研究91-101
- 材料与方法91-95
- 1 材料与试剂91
- 2 实验设备和仪器91-92
- 3 实验方法和步骤92-95
- 结果95-97
- 讨论97-99
- 结论99-100
- 参考文献100-101
- 技术路线101-102
- 综述102-111
- 参考文献107-111
- 作者简介（学习及工作经历、读研期间主要成果）111-112
- 致谢112
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1 刘海军;生物钟蛋白Cry1与肿瘤的关联性[D];皖南医学院;2015年
，本文编号：1081686
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