体细胞重编程过程中Pkm2表达特征和功能研究

发布时间：2017-10-25 00:02

  本文关键词：体细胞重编程过程中Pkm2表达特征和功能研究

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【摘要】：实验目的:癌症是世界严重的公共卫生问题,据国际癌症研究机构公布的数据显示,每年全球约800万人死于癌症。在我国每6分钟就有一人被确诊为癌症,每天有8550人成为癌症患者。因此,深入认识癌症并寻找诊断治疗癌症的靶标刻不容缓。生物体的生存离不开能量的供应,肿瘤细胞也不例外。恶性肿瘤在有氧环境下仍然保持异常旺盛的糖酵解(Warburg效应),这种代谢的转变是为了满足肿瘤增殖活力和生物合成的需求,其中一个起重要作用的关键酶便是丙酮酸激酶,其与多种肿瘤的分期分型、恶性程度等密切相关。但在肿瘤发生早期,Pkm2是如何发挥作用的,其复杂的表达调控是如何建立的尚不清楚。这是由于肿瘤发生的过程不能够被人们捕捉的原因。随着对肿瘤各方面性质的深入研究,人们发现肿瘤与干细胞存在密切联系,如Wnt、Notch、SHH等信号通路的相似性,ES特异基因Oct4、Sox2、Nanog等在肿瘤中同样高表达等。因此,我们拟把重编程过程作为模拟肿瘤发生的体外研究平台,研究Pkm2在重编程过程中的表达模式及功能,探讨其对重编程过程的影响和调控,为揭示Pkm2在肿瘤发生中的表达调控并发现新的潜在诊疗靶标提供理论基础。实验方法:首先,我们利用构建成功的二次重编程系统小鼠制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)。然后利用MEF细胞在含有强力霉素(Dox)的ES培养基中诱导重编程,成功得到诱导多功能干细胞(iPS cell)。随后,利用shRNA将Pkm敲低后进行诱导,观察克隆生成情况。为了检测重编程过程中Pk基因的表达变化,我们在诱导过程中在不同的时间点取样,用qPCR和Western Blot分别检测Pkm1,pkm2的表达情况,对它们的表达变化进行分析。最后,通过qPCR检测Pkm2的相关调控基因的表达。根据已知的Pkm2基因在肿瘤细胞中的调控情况,探寻在肿瘤细胞中相关调控基因Ptb,hnRANPA1,hnRNPA2B1,Hif-1α等在重编程过程中的表达趋势。然后对它们进行上调或者敲低表达后,观察其对重编程过程的影响及对Pkm2、Pkm1基因的调控作用。Pk基因的几种亚型中,只有Pkm2能够被变构调节:低激酶活性的二聚体形式和高激酶活性的四聚体形式。在肿瘤细胞中高表达Pkm2二聚体形式,而高激酶活性的Pkm2四聚体形式表达较低。我们将利用Western Blot检测在重编程过程中Pkm2两种变构形式的变化关系。实验结果:1、Pkm2在重编程过程中起到重要作用,不可或缺;2、Pkm2在多能细胞中入核或可作为转录因子参与基因调控;3、Pkm2在重编程过程中与其在肿瘤细胞已知的相关特征相一致,可以通过对重编程过程的研究构建其调控网络,进一步探索新的可能的调控因子。
【关键词】：诱导多能干细胞 重编程 丙酮酸激酶M2型
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 第1章 前言11-17
• 一、研究背景11-16
• 1、国内外肿瘤现状11
• 2、肿瘤能量代谢特点11-12
• 3、PK在正常细胞和肿瘤细胞的表达模式12-13
• 4、肿瘤细胞中Pkm2与Pkm1的调节转换13
• 5、Pkm2在肿瘤细胞中的功能13-14
• 6、Pkm2的高表达与肿瘤的关系及研究现状14-15
• 7、利用重编程过程模拟肿瘤发生的过程15-16
• 二、研究思路16-17
• 1、技术路线16
• 2、研究内容16
• 3、总结16-17
• 第2章 材料和方法17-45
• 一、材料和仪器17-19
• 1、实验动物17
• 2、实验材料17-18
• 3、实验仪器18-19
• 二、方法19-45
• 1、pFUW-Tet-On表达载体的构建19-27
• 2、p Sico-sh表达载体的构建27-30
• 3、i PS细胞系的建立和培养30-35
• 4、i PS细胞系的鉴定35-45
• 第3章 实验结果45-53
• 一、可诱导型i PS细胞系的建立45-46
• 二、Pkm2在不同细胞中的表达情况46-47
• 三、Pkm在重编程过程中的表达47-48
• 四、敲低Pkm的表达对重编程过程的影响48-49
• 五、小结49
• 六、构建Pkm2相关载体进行深入研究49-50
• 七、Pkm2作为调控因子参与基因调控50-51
• 八、FUW-3F-Pkm2-P2A-MKO标签表达载体的构建51-52
• 九、总结52-53
• 第4章 总结与讨论53-56
• 第5章 参考文献56-59
• 综述 丙酮酸激酶M2型（PKM2）在肿瘤细胞中的功能及调控59-68
• 参考文献65-68
• 致谢68-69

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本文编号：1091125