雄激素受体对三阴性乳腺癌增殖调控作用的研究

发布时间：2017-10-25 06:43

  本文关键词：雄激素受体对三阴性乳腺癌增殖调控作用的研究

  更多相关文章： 雄激素受体 三阴性乳腺癌 p53 p73 p21

【摘要】：研究背景：恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一,在中国,已经成为疾病的死因之首,其发病率与死亡率每年都在升高。近些年,恶性肿瘤已经成为中国重要的公共健康问题。研究表明,乳腺癌是全球女性发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。最新发布的中国2015年癌症统计数据显示,女性常见的恶性肿瘤为：结直肠癌、支气管肺癌、乳腺癌、胃癌及食管癌,占据所有女性恶性肿瘤发病例数的近60%,其中乳腺癌发生率为女性所有恶性肿瘤中的15%,其发病率占据首位。乳腺癌的发病人群主要集中于30-59岁的女性,是45岁以下女性常见的癌症死亡原因。如今,越来越多的女性受到乳腺癌的威胁。因此,肿瘤发生发展机制的研究及乳腺癌的治疗已经成为目前研究者关注的热点。肿瘤的发生是一个复杂的、多基因驱动的过程。最新的研究表明,肿瘤的演化经过3个不同的阶段：突破阶段、扩张阶段与浸润阶段。每个阶段都涉及多种基因的驱动,在合适的局部环境下,多种基因相互影响最终导致了肿瘤的发生。不同肿瘤的发生涉及不同的生长调控通路的激活。乳腺癌是一种激素依赖性肿瘤,其中激素受体在乳腺癌的发生发展中扮演着重要的角色,根据激素受体表达情况的不同可将乳腺癌分为4种不同的分子分型：Luminal A,Luminal B,人类表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER-2)过表达与基底样型。其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)与基底样型乳腺癌大约有80%的重合,是一类特殊类型的乳腺癌。TNBC大约占侵袭性乳腺癌的10%-20%,具有恶性程度高、侵袭能力强、复发率高的特点,与其他类型的乳腺癌相比,其5年生存率及总生存率更低。由于缺乏常见激素受体的表达,如雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)与HER-2,针对ER、HER-2的内分泌及分子靶向治疗并不能在这一类人群中获益。除此以外,TNBC恶性程度高,与其他类型乳腺癌相比肿瘤体积大、分期高、诊断初期发生淋巴结侵袭的几率高。尽管TNBC缺乏ER、PR及HER-2表达,有研究表明TNBC中还存在其他受体表达,如胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor,IGFR)、雄激素受体(androgen receptor,AR)等。AR与ER同为核激素受体,其在超过三分之一的TNBC中有表达,在体内、体外实验中均有证明AR能促进乳腺癌细胞的增殖。运用药物性AR阻断剂比卡鲁胺能有效抑制AR阳性TNBC细胞的增殖,使肿瘤生长减慢。为了进一步验证AR抑制剂的安全性及有效性,有临床研究表明,运用比卡鲁胺在ER(-)/PR(-)/AR(+)转移性乳腺癌中能获得19%临床获益率。另有一项Ⅱ期临床试验评估新一代AR抑制剂恩杂鲁胺在TNBC中安全性的研究也在进行中(NCT01889238).除此以外,有病例分析报道,一位55岁的AR阳性转移性TNBC女性,接受每日150mg口服比卡鲁胺治疗,4个月后达到了临床获益。AR与ER同为核激素受体,是配体依赖性转录因子,可作用于下游靶基因启动子结合位点调控下游基因的表达,影响细胞的功能。为了进一步研究AR在TNBC中的作用,我们在AR激动剂及拮抗剂处理后检测了细胞中p53、p73、p21及Cyclin D1的表达。p53是经典的抑癌基因,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。p53与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化密切相关。然而,p53在人类肿瘤中是突变率最高的抑癌基因。有研究表明,突变的p53特别是常见的突变位点的p53不仅会丧失野生型p53抑制肿瘤的作用,还会有诱导肿瘤发生的作用。在TNBC中,p53突变较为常见。而p73属于p53超家族的成员,在肿瘤中的突变发生率较低,1997年由学者Kaghad等发现位于1p36上的基因。p73基因在肿瘤中能发挥抑制肿瘤增殖、诱导凋亡的作用。p53在肿瘤细胞中能活化下游多种信号通路,细胞周期依赖性激酶抑制因子p21是p53信号通路中的关键因子,能够通过p53依赖或非依赖性途径引起细胞周期阻滞,影响肿瘤细胞的分化。研究目的与意义：TNBC是乳腺癌中的一特殊类型,侵袭性及恶性程度较高,复发率及死亡率一直居高不下。ER、PR及HER-2在TNBC中表达为阴性。靶向ER及HER-2的乳腺癌内分泌治疗及分子靶向治疗并不能在TNBC中获益,因此缺乏有效治疗方法的情况下,与其他类型乳腺癌相比TNBC总体生存率与无进展生存期更低。研究表明AR在TNBC中有一定量的表达,近些年AR成为乳腺癌中预后及治疗预测因子,越来越多的研究者关注AR在乳腺癌特别是TNBC中的作用。本研究旨在探究靶向AR是否能影响TNBC细胞增殖及相关蛋白(p53、p73、p21及Cyclin D1)的表达,为了解AR在TNBC中的作用及为其用于临床治疗提供理论依据。研究方法：本研究运用AR激动剂双氢睾酮(5-a-dihydrotestosterone,DHT)及拮抗剂比卡鲁胺(bicalutamide)处理TNBC细胞株(MDA-MB-231及Hs578T),观察AR对TNBC细胞增殖、凋亡的影响；并在细胞及小鼠水平检测双氢睾酮及比卡鲁胺处理后对AR及相关蛋白(p53、p73、p21、Cyclin D1)水平表达的变化,揭示了AR对p73、p21蛋白表达调控的可能机制。为深入理解AR在调控TNBC增殖中的作用与AR抑制剂用于AR阳性的TNBC治疗提供理论依据。本研究选择两株TNBC细胞株(MDA-MB-231,Hs578T)、Bab1/c小鼠作为研究对象进行研究。具体实验方法如下：1.通过MTT(溴化噻唑蓝四氮唑)比色法、细胞计数及流式细胞术检测AR激动剂双氢睾酮、拮抗剂比卡鲁胺对TNBC细胞增殖与凋亡的影响。2.通过免疫印迹(Western Blotting)检测双氢睾酮、比卡鲁胺处理后对肿瘤增殖相关蛋白p53、p73、p21及Cyclin Dl蛋白水平表达的影响。3.通过生物信息学在线预测软件预测AR与p73、p21结合位点的结合,运用染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)、琼脂糖凝胶电泳PCR验证AR与p73、p21的结合情况,对比双氢睾酮处理后与对照组相比结合位点的差异,探讨AR在双氢睾酮作用后对p73及p21表达调控的可能机制。4.通过用Babl/c小鼠及TNBC细胞株MDA-MB-231建立皮下移植瘤模型,建瘤成功后给予双氢睾酮、比卡鲁胺处理,观察用药后不同处理组肿瘤大小变化及通过免疫组化检测不同处理后肿瘤组织中AR、p73及p21的表达变化。实验结果：1.MTT实验证实,与对照组相比,AR激动剂双氢睾酮处理后TNBC细胞株MDA-MB-231及Hs578T增殖加快,细胞早期凋亡率减小；而拮抗剂比卡鲁胺作用后,TNBC细胞MDA-MB-231及Hs578T增殖受到抑制,早期凋亡率增加。2.细胞计数实验结果显示：随着时间的递增,细胞数目增加,与对照组相比,TNBC细胞株MDA-MB-231在双氢睾酮处理后细胞数目增加更快,抑制剂比卡鲁胺用药组细胞数目增加减慢。Hs578T细胞株实验组也得到相似的结果。3.免疫印迹实验结果显示：双氢睾酮能增加MDA-MB-231细胞株中AR、p53及Cyclin D1蛋白表达,减少p73、p21蛋白表达；比卡鲁胺抑制AR、p53及Cyclin D1蛋白表达,对p73、p21的表达作用则相反。而在Hs578T中双氢睾酮对p73表达调控作用并不明显。4.通过生物信息学在线软件预测到AR与p73、p21启动子区均有结合位点,ChIP实验发现AR能够与p73、p21基因启动子区结合,并且双氢睾酮的处理对结合有影响作用。5.双氢睾酮、比卡鲁胺处理裸鼠移植瘤出现肿瘤体积差异,双氢睾酮促进肿瘤生长,免疫组化结果显示AR表达增加,p73及p21表达均有下调,比卡鲁胺能抑制移植瘤生长,AR表达下调,p73及p21增加。结论：AR在MDA-MB-231及Hs578T两株TNBC细胞株中均有表达,运用AR激动剂双氢睾酮能促进AR蛋白水平在两株细胞中升高,而AR拮抗剂比卡鲁胺处理后AR表达水平有所下降。说明双氢睾酮及比卡鲁胺在两株细胞中是有效的。进一步实验证明,AR可通过雄激素双氢睾酮被活化,上调突变p53、下调p73及p21的表达,从而促进AR阳性的TNBC细胞的增殖。AR抑制剂比卡鲁胺可下调突变p53、促进p73、p21表达,诱导TNBC细胞株凋亡,抑制细胞增殖。ChIP实验还发现,AR能与p73、p21启动子区结合,AR对p73、p21的调控主要通过结合其启动子区实现。双氢睾酮处理能促进AR与p73及p21启动子区的结合。研究证明,AR对TNBC增殖有调控作用,抑制AR的活性能一定程度地抑制AR阳性乳腺癌细胞的增殖,我们认为靶向AR有可能使AR阳性的TNBC患者在临床上获益,延长生存时间。
【关键词】：雄激素受体 三阴性乳腺癌 p53 p73 p21
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-21
• 第一章 实验材料21-24
• 1.1 细胞株、Balb/c小鼠及实验体系21
• 1.2 药品与试剂21-22
• 1.3 材料与仪器22-24
• 第二章 实验方法24-42
• 2.1 细胞培养方法及药物配制24
• 2.2 MTT比色法检测细胞增殖24-25
• 2.3 细胞计数法测定细胞增殖25-26
• 2.4 Annexin/PI染色检测细胞凋亡26-27
• 2.5 蛋白质提取与浓度测定27-28
• 2.6 蛋白质免疫印迹(Western Blotting)28-33
• 2.7 ChIP实验33-37
• 2.8 裸鼠移植瘤模型37-38
• 2.9 组织取材、固定与包埋蜡块38-39
• 2.10 苏木精-伊红染色(H&E染色)39-40
• 2.11 免疫组织化学(IHC)40-41
• 2.12 统计学分析41-42
• 第三章 实验结果42-52
• 3.1 AR在TNBC细胞株中表达42
• 3.2 AR激动剂双氢睾酮及拮抗剂比卡鲁胺对TNBC细胞株功能作用的影响42-44
• 3.2.1 AR激动剂双氢睾酮及拮抗剂比卡鲁胺对TNBC细胞增殖的影响42-43
• 3.2.2 AR激动剂双氢睾酮及拮抗剂比卡鲁胺对TNBC细胞凋亡的影响43-44
• 3.3 AR对TNBC细胞株MDA-MB-231及Hs578T中相关蛋白表达水平的影响44-47
• 3.3.1 AR对MDA-MB-231、Hs578T细胞株中p53蛋白水平表达的影响44-46
• 3.3.2 AR对MDA-MB-231、Hs578T细胞株中p73、p21、Cyclin D1蛋白水平表达的影响46-47
• 3.4 AR与p73及p21启动子区结合情况47-49
• 3.4.1 生物信息学分析AR与p73、p21启动子区结合情况47
• 3.4.2 ChIP实验检测AR与p73及p21结合情况47-49
• 3.5 AR对TNBC裸鼠移植瘤的影响49-52
• 3.5.1 AR对TNBC裸鼠移植瘤生长的作用49-50
• 3.5.2 AR对TNBC裸鼠移植瘤组织中蛋白水平表达的影响50-52
• 第四章 讨论52-57
• 第五章 全文总结57-59
• 参考文献59-65
• 综述65-76
• 参考文献71-76
• 攻读硕士期间发表论文76-77
• 致谢77-78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 黄啸原;用“印度阅兵”形容乳腺癌合适吗?[J];诊断病理学杂志;2001年02期

2 张嘉庆,王殊,乔新民;乳腺癌的现状和远景[J];中华外科杂志;2002年03期

3 张维彬,汪波,石灵春;中医药在现代乳腺癌治疗中的运用[J];中国中西医结合急救杂志;2002年01期

4 薛志勇;食物与乳腺癌[J];山东食品科技;2002年04期

5 王旬果,王建军,郑国华;乳腺癌相关标志物的研究进展[J];山东医药;2002年33期

6 陆尚闻;;男人也患乳腺癌[J];环境;2003年12期

7 ;新技术清晰拍摄早期乳腺癌细胞[J];上海生物医学工程;2005年04期

8 田富国;郭向阳;张华一;;乳腺癌诊治研究新进展[J];肿瘤研究与临床;2005年S1期

9 马涛,谷俊朝;血管内皮生长因子与乳腺癌的临床研究进展[J];国外医学(外科学分册);2005年01期

10 郭庆良,谷俊朝;乳腺癌和瘦素相关性研究进展[J];国外医学.外科学分册;2005年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 于永利;;抗乳腺癌免疫治疗融合蛋白[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

2 郭红飞;;中医治疗乳腺癌的策略[A];江西省中医、中西医结合肿瘤学术交流会论文集[C];2012年

3 庞朋沙;伍会健;;乳腺癌治疗靶标的研究进展[A];北方遗传资源的保护与利用研讨会论文汇编[C];2010年

4 陆劲松;邵志敏;吴炅;韩企夏;沈镇宙;;新型维甲酸抑制乳腺癌细胞的生长及诱导凋亡的机制研究[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

5 刘爱国;胡冰;;乳腺癌临床治疗进展[A];安徽省抗癌协会第四次代表大会暨乳腺癌、肺癌专业委员会成立会议、安徽省肿瘤防治进展学术研讨会论文汇编[C];2001年

6 张嘉庆;王殊;乔新民;;乳腺癌的现状和远景[A];第一届全国中西医结合乳腺疾病学术会议论文汇编[C];2002年

7 刘清俊;;乳腺癌综合治疗的新进展[A];山西省抗癌协会第六届肿瘤学术交流会论文汇编[C];2003年

8 邵志敏;;21世纪乳腺癌治疗的展望[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

9 陈松旺;张明;;乳腺癌治疗的回顾与展望[A];西部地区肿瘤学学术会议论文汇编[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凯阳;王兆钺;阮长耿;;组织因子途径抑制物-2在乳腺癌细胞中的表达研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 ;血检有望揭示乳腺癌治疗效果[N];医药经济报;2004年

2 记者 郑晓春;乳腺癌细胞扩散基因被找到[N];科技日报;2007年

3 中国军事医学科学院肿瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新疗法[N];中国妇女报;2002年

4 王艳红;抑制ＤＮＡ修补可消灭乳腺癌细胞[N];医药经济报;2005年

5 詹建;乳腺癌饮食 两个时期不一样[N];中国中医药报;2006年

6 辛君;乳腺癌扩散基因“浮出水面”[N];大众卫生报;2009年

7 记者 毛黎;美发现有效抑制乳腺癌细胞生长的分子[N];科技日报;2010年

8 记者 吴春燕　通讯员 王丽霞;乳腺癌治疗将有新途径[N];光明日报;2011年

9 王乐　沈基飞;我科学家发现导致乳腺癌耐药的新标志物[N];科技日报;2011年

10 刘霞;一种天然分子能阻止乳腺癌恶化[N];科技日报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 柴红燕;疾病状态下CYP4Z1和4A的生物学行为及其药物干预研究[D];武汉大学;2012年

2 李凯;ID(inhibitor of DNA binding)家族蛋白调控乳腺细胞的分化并影响乳腺癌的预后[D];复旦大学;2014年

3 江一舟;乳腺癌新辅助化疗前后基因变异检测及其功能论证[D];复旦大学;2014年

4 马邵;酪氨酸去磷酸化增强表皮生长因子受体在乳腺癌治疗中靶向性的研究[D];山东大学;2015年

5 姚若斯;精氨酸甲基转移酶PRMT7诱导乳腺癌细胞发生表皮—间质转换及转移的作用机制研究[D];东北师范大学;2015年

6 侯培锋;α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)诱发高致瘤性干细胞样乳腺癌细胞机制研究[D];福建医科大学;2014年

7 李丽丽;分泌蛋白SHON调控乳腺癌细胞EMT的分子机制研究[D];东北师范大学;2015年

8 陈丽艳;PI3K抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乳腺癌协同杀伤作用的分子机制研究[D];延边大学;2015年

9 朴俊杰;乳腺癌差异基因筛选及PAIP1对其生物学行为的影响[D];延边大学;2015年

10 汪[?如;染色体6q25.1区域基因多态性与乳腺癌遗传易感性的关联研究[D];南方医科大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 杜文英;乳腺癌分子亚型的临床与病理特点[D];郑州大学;2011年

2 单系金;Mfn2磷酸化修饰对其调控乳腺癌细胞增殖功能的重要性的研究[D];河北联合大学;2014年

3 徐晶;缺氧对乳腺癌细胞miR-210表达及侵袭能力的影响[D];河北联合大学;2014年

4 李丽;Mfn2对乳腺癌细胞MCF-7侵袭迁移能力的影响及机制探究[D];河北联合大学;2014年

5 杨洋;醌氧化还原酶及其抑制剂在乳腺癌增殖与迁移中的作用研究[D];延边大学;2015年

6 张秀娟;免疫组化与荧光原位杂交检测乳腺癌Her-2表达的对比研究及17号染色多体对检测结果的影响[D];泰山医学院;2014年

7 韩晶;纳米脂质体多西他赛抑制乳腺癌细胞增殖降低骨髓毒性的机制[D];安徽大学;2015年

8 钟显峰;乳腺癌的分子亚型与淋巴结转移的关系研究[D];泰山医学院;2014年

9 张硕稳;MTDH、IκB、NF-κB P65在乳腺癌组织中的表达及意义[D];河北医科大学;2015年

10 谢少利;RNAi阻低UBE3A后对乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学行为的影响及其机制研究[D];川北医学院;2015年

，

本文编号：1092557