妊娠期乳腺癌差异基因的筛选及FBXW7在乳腺癌中的功能研究

发布时间：2017-10-26 02:36

  本文关键词：妊娠期乳腺癌差异基因的筛选及FBXW7在乳腺癌中的功能研究

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【摘要】：乳腺癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居女性常见肿瘤首位。随着我国经济的不断发展,以及女性生活方式的转变,我国乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,在发病群体中也呈现出年轻化趋势。诱发乳腺癌的因素有多种,BMI值、乳腺癌家族史、初潮年龄、绝经年龄以及生活压力、生活习惯等都与乳腺癌的发病危险性相关。随着分子生物学和基因组学的不断深入发展,人们认识到乳腺癌的发生与基因的突变密切相关,在乳腺癌的发生、发展中涉及了多种基因改变。随着基因在乳腺癌发病机制中的作用的不断深入研究,人们急切寻找可以有效降低乳腺癌发病率的相关基因,为早期诊断乳腺癌和治疗乳腺癌提供有效的途径。随之产生的基因治疗也逐渐成为治疗乳腺癌的重要方法,如癌基因和抑癌基因治疗方法,自杀基因治疗方法和免疫基因治疗方法,都是基于人们对乳腺癌相关基因的深入了解。加以传统的手术以及放射治疗、化疗,提高了乳腺癌的治疗成功率。因此,研究基因在乳腺癌中的致病机制具有重要意义。在人类基因组研究的推动下,基因组学得到了快速发展。随之产生的基因芯片技术也在基因组学领域被广泛应用。应用基因芯片技术可快速高效检测组织或细胞中的基因表达特点,从而发现疾病中基因的差异表达情况,在肿瘤中的应用尤为常见。基因芯片的发展使基因功能研究也迅速发展,产生了大量的基因芯片信息,有待研究者们进一步的深入挖掘其深层意义。妊娠期乳腺癌是乳腺癌中的一种特殊类型,原发性乳腺癌确诊时间在妊娠期或哺乳期或产后一年内可成为妊娠期乳腺癌。在本研究中,我们利用生物信息数据库,从现有的妊娠期乳腺癌基因芯片研究成果中搜索相关的表达谱基因芯片数据集,并筛选了在妊娠期乳腺癌与正常组织当中差异表达的基因,再通过生物信息学研究工具预测这些差异基因可能涉及的生物功能以及信号传导通路。结合文献检索,最后筛选出一个可能与乳腺癌相关性较强的基因FBXW7作为下一步体外细胞实验的目标。FBXW7基因属于蛋白酶体系统的组成成员,是泛素SCF连接酶的组成蛋白。参与蛋白酶体系统地免疫调控、细胞代谢调控以及信号转到等多种重要的调控过程。研究表明,FBXW7基因在肝癌、宫颈癌、脑胶质瘤以及胃癌中与其癌旁组织都存在不同程度的表达差异,并影响了细胞或组织的侵袭、转移调控,细胞的周期调控和机体的免疫调控等重要生物学过程,在多种肿瘤疾病中有着重要的作用。为进一步探索FBXW7对乳腺癌的影响和作用机制,本研究采用FBXW7高表达重组质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,并通过CCK8, transwell实验检测细胞增殖和迁移、侵袭能力,流式细胞仪检测细胞周期、凋亡的变化。从而从细胞水平阐明FBXW7对乳腺癌细胞的生物学作用。研究方法：1.妊娠相关性乳腺癌芯片数据从美国国立生物信息中心NCBI数据库GEO中下载。在GEO Datasets数据库搜索中以Pregnancy Associated Breast Cancer为检索词,查找并下载数据集。将数据集导入Qlucore Omics Explorer 3.0软件,对芯片数据进行统计学分析。对数据信息进行有效过滤,筛选出表达相对于正常组上调或下调的差异基因。2.在生物学信息注释数据库DAVID在线网站中将筛选出的差异上调或下调表达基因导入,选择DAVID软件中的基因功能注释,对这些差异基因分别进行生物学过程、分子功能、细胞组成以及生物学信号通路分析。3.结合文献,筛选出与乳腺癌相关性较大的基因做后续研究。对筛选出的基因使用PredictProtein在线网站输入基因的氨基酸序列,选择功能预测栏目预测该基因的分子功能和生物学进程。4.构建FBXW7过表达质粒载体,转染MCF-7乳腺癌细胞作为实验组(FBXW7),同时空载体质粒转染组作为阴性对照组(NC),未经转染的细胞作为空白对照组(Control)。qRT-PCR和WB实验验证质粒转染效率以及FBXW7 mRNA和蛋白在MCF-7中的表达。MCF.7细胞转染FBXW7过表达质粒后,CCK8实验检测细胞的增值活性；transwell实验检测细胞的迁移能力和侵袭能力；流式细胞仪检测细胞的周期分布和凋亡情况。讨论FBXW7过表达对MCF.7细胞的生物学行为影响。研究结果：1.妊娠相关性乳腺癌差异基因的筛选在GEO Datasets数据库搜索中以Pregnancy Associated Breast Cancer为检索词,搜索到数据集GSE31192。Qlucore Omics Explorer 3.0软件对数据集进行差异表达基因的筛选,共筛选出差异表达基因148个,其中乳腺癌细胞中高表达基因有24个,低表达基因有124个。2.妊娠相关性乳腺癌差异基因的生物信息学分析将筛选出的148个差异表达基因上传至DANID,进行基因的功能注释和信号传导通路分析,结果表明这些差异基因在功能上主要聚类于细胞磷酸盐代谢过程、细胞骨架蛋白结合、细胞分化、有丝分裂周期、血管发育、调节蛋白激酶活性,聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控,胞膜囊泡组成等。差异基因所涉及的KEGG通路主要是粘着斑信号通路、血管平滑肌细胞收缩信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架通路、黑色素瘤疾病通路、MAPK信号通路和细胞外基质受体相互作用等信号通路。3.选定差异基因并预测其功能根据妊娠相关性乳腺癌差异基因的生物信息学分析结果,查阅相关文献,综合评比筛选出FBXW7可能作用于乳腺癌的基因为下一步研究目标。PredictProtein在线网站预测FBXW7基因的分子功能和生物学进程。预测结果显不,FBXW7分子功能主要涉及核酸结合、转录因子结合、周期蛋白结合和动力蛋白等的结合。FBXW7参与的生物学过程主要有细胞代谢过程、细胞周期的调节等。4.构建FBXW7过表达重组质粒并检测其转染效果构建FBXW7过表达重组质粒pEZ-M02-FBXW7后经扩大培养并筛选阳性克隆,PCR鉴定与测序结果显示,重组克隆与理论预测序列一致,FBXW7过表达重组质粒构建成功。将FBXW7过表达重组质粒pEZ-M02-FBXW7转染MCF-7乳腺癌细胞,qRT-PCR实验和WB实验结果表明,经转染的MCF-7细胞实验组(FBXW7)中FBXW7的mRNA水平以及FBXW7蛋白水平相较于阴性对照组(NC),空白对照组(Control)均有明显提高。5. FBXW7过表达对MCF-7细胞的生物学行为影响(1)CCK8实验检测细胞的增值活性。FBXW7过表达质粒转染后MCF-7细胞后,CCK8法检测细胞的增殖情况。结果显示,实验组(FBXW7)的细胞在第36小时后OD值显著低于阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞,差异均有统计学意义(P0.05)；阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞间差异无统计学意义(P0.05)。(2)transwell实验检测细胞的迁移能力和侵袭能力。FBXW7过表达质粒转染MCF-7细胞后,tanswell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。细胞迁移结果显示,实验组(FBXW7)细胞迁移过小室膜的数目明显少于阴性对照组(NC)和空白对照组(Control),差异具有统计学意义(P0.05)：阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞间差异无统计学意义(P0.05)。细胞侵袭结果显示,实验组(FBXW7)细胞侵袭过小室膜的数目明显少于阴性对照组(NC)和空白对照组(Control),差异具有统计学意义(P0.05)；阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞间差异无统计学意义(P0.05)。(3)流式细胞仪检测细胞的周期分布。FBXW7过表达质粒转染MCF-7细胞后,FCM法检测细胞周期分布情况。结果显示,实验组(FBXW7)细胞在G0/G1期所占百分比高于阴性对照组(NC)和空白对照组(Control),差异具有统计学意义(P0.05)；阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞的细胞周期分布间差异无统计学意义(P0.05)。三组在G2/M期细胞所占百分比无统计学差异(P0.05)(4)流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。FBXW7过表达质粒转染MCF-7细胞后,FCM法检测细胞凋亡情况。结果显示,实验组(FBXW7)细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均高于阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)差异具有统计学意义(P0.05)；阴性对照组(NC)和空白对照组(Control)细胞间的细胞凋亡差异无统计学意义(P0.05)。结论：利用生物信息学方法筛选到妊娠期乳腺癌患者与正常人群的差异基因共148个,其中表达上调24个,下调124个。这些基因参与了众多与乳腺癌相关的生物学过程和信号通路,进一步进行文献挖掘,筛选出与乳腺癌发生发展的相关基因FBXW7。在对FBXW7基因功能的生物信息学分析基础上,选取MCF-7乳腺癌细胞进行体外实验。结果表明,FBXW7高表达可抑制乳腺癌细胞MCF-7增值、侵袭和迁移能力,并将细胞阻滞于GO/G1期,且能促进细胞凋亡。
【关键词】：乳腺肿瘤生物信息学 FBXW7 基因细胞增殖细胞转移细胞凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9;R714.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一章 妊娠期乳腺癌相关基因的生物信息学分析20-36
• 1.1 材料与方法20-22
• 1.2 结果22-33
• 1.3 讨论33-36
• 第二章 过表达FBXW7在乳腺癌细胞MCF-7中的功能研究36-63
• 2.1 材料与方法36-53
• 2.2 结果53-61
• 2.3 讨论61-63
• 参考文献63-69
• 英文缩略词表69-71
• 攻读学位期间成果71-72
• 致谢72-73

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