基于表面等离子体共振技术和磁性微球免疫荧光技术对肿瘤标志物的新型分析方法研究

发布时间：2017-10-26 05:23

  本文关键词：基于表面等离子体共振技术和磁性微球免疫荧光技术对肿瘤标志物的新型分析方法研究

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【摘要】：与检测肿瘤标志物的传统方法相比,表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术能够实现实时、在线检测,实验过程无需标记,操作简单,灵敏度高,而免疫磁珠(Immonumagnetic beads,IMBs)由于具有操作简单、分离速度快、分离效率高、分离过程高保真等诸多优点而被广泛应用于各个领域,在本文中,使用SPR生物传感器对肿瘤标志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)进行检测,并引入生物素-链霉亲和素纳米金放大传感信号,提高了检测的灵敏度,并以磁性微球为载体,结合免疫荧光,使用夹心法对CEA进行了定性和半定量检测。第一章:本章分别介绍了肿瘤标志物的检测意义、概念、分类及其检测方法,对SPR技术的原理、优点、检测方法及其应用做了简要的阐述,对免疫磁珠的组成、原理、优点及其应用等进行了概述,在此基础上阐述了本文研究的主要内容。第二章:基于SPR技术,分别采用直接法和双抗体夹心法对癌胚抗原进行检测。对偶联条件溶液pH、流速及抗体浓度进行了考察和优化,最后选择在pH为4.5、流速为10μL/min、浓度为100μg/m L的条件下,对单克隆抗体mAbCEA-C3进行偶联,偶联量为8.475 ng?mm-2。使用直接法测CEA,检测限为12.78 ng/mL。为了提高灵敏度,降低检测限,使用双抗体夹心模式对CEA进行了检测,得到检测限为3.3 ng/m L。与直接法相比,夹心法使灵敏度提高了4.2倍。对人血清加标样品进行检测,样品回收率为102.56%~106.86%,相对标准偏差为4.96%~8.99%,实现了对CEA的快速灵敏检测。第三章:为了进一步提高灵敏度,在使用SPR生物传感器时引入胶体金对信号进行二次放大。首先对链霉亲和素(Streptavidin,SA)标记胶体金的最小蛋白量进行了选择,并对吸附在纳米金颗粒上的SA的量及其活性位点进行了定量检测。结果表明在1 mL胶体金上偶联了8.5μg SA,偶联率为42.5%,每个纳米金颗粒上平均连接了11.92个SA分子,可结合位点数为33.10个,每100 nm2纳米金上的SA有4.69个可结合位点。使用纳米金增强的夹心法检测CEA,SPR响应信号和CEA浓度在1 ng/mL~60 ng/mL具有良好的线性关系,线性方程为:Y=59.8100+6.8540X(ng/m L),R2=0.9772,与夹心法相比,灵敏度提高了3.3倍。结果表明:该方法准确可靠,可用于人血清中CEA的检测。第四章:利用磁性微球结合免疫荧光对CEA进行了定性和半定量检测。首先使用EDC/NHS法活化磁珠上羧基使之与CEA单克隆抗体进行偶联,制成免疫磁珠,用于CEA的捕获。对样品的洗涤次数和免疫反应时间进行了优化,最后选择免疫时间为45 min,洗涤三次。在优化条件下对混合样品中的CEA进行捕获,再使用荧光显微镜进行检测。结果表明,随着CEA浓度的增加,磁性微球表面的荧光强度增强,从而实现了对CEA快速准确的定性和半定量检测。
【关键词】：肿瘤标志物 癌胚抗原 SPR技术 磁性微球 免疫荧光
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4;O657
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-28
• 1.1 肿瘤标志物概述11-16
• 1.1.1 检测肿瘤标志物的目的与意义11
• 1.1.2 肿瘤标志物的概念与特点11-12
• 1.1.3 肿瘤标志物的检测方法12-16
• 1.1.3.1 免疫分析法12-14
• 1.1.3.1.1 放射性免疫分析法12
• 1.1.3.1.2 酶联免疫吸附分析法12-13
• 1.1.3.1.3 化学发光免疫分析法13-14
• 1.1.3.1.4 免疫荧光分析法14
• 1.1.3.2 免疫传感器14-16
• 1.1.3.2.1 电化学免疫传感器15
• 1.1.3.2.2 压电免疫传感器15-16
• 1.1.3.2.3 表面等离子体共振生物传感器16
• 1.2 表面等离子体共振（SPR）技术概述16-24
• 1.2.1 SPR技术的基本原理16-17
• 1.2.2 SPR技术的主要优势17
• 1.2.3 SPR生物传感器17-19
• 1.2.4 SPR技术的检测方法19-21
• 1.2.5 SPR技术的应用21-24
• 1.2.5.1 SPR技术在医学诊断中的应用21-22
• 1.2.5.2 SPR技术在环境检测中的应用22-23
• 1.2.5.3 SPR技术在食品安全中的应用23-24
• 1.3 免疫磁珠概述24-27
• 1.3.1 免疫磁珠的组成24
• 1.3.2 免疫磁珠分离富集原理24-25
• 1.3.3 免疫磁珠分离富集优势25
• 1.3.4 免疫磁珠应用25-27
• 1.3.4.1 免疫磁珠在食品安全中的应用25-26
• 1.3.4.2 免疫磁珠在医学诊断中的应用26
• 1.3.4.3 免疫磁珠在生物分离中的应用26-27
• 1.4 本文所进行的研究27-28
• 第2章 基于SPR技术的癌胚抗原的检测28-38
• 2.1 前言28
• 2.2 实验部分28-30
• 2.2.1 主要仪器和试剂28-29
• 2.2.2 溶液的配制29
• 2.2.3 鼠抗癌胚抗原单克隆抗体抗体偶联条件的选择29-30
• 2.2.4 鼠抗癌胚抗原单克隆抗体偶联过程30
• 2.2.5 选择芯片再生条件30
• 2.2.6 癌胚抗原的检测30
• 2.3 结果与讨论30-37
• 2.3.1 鼠抗癌胚抗原的偶联条件30-32
• 2.3.2 鼠抗癌胚抗原的偶联结果32-33
• 2.3.3 再生条件33
• 2.3.4 直接法检测CEA33-35
• 2.3.5 探寻合适的mAbCEA-B5的浓度35
• 2.3.6 夹心法检测CEA35-36
• 2.3.7 回收率实验36-37
• 2.4 结论37-38
• 第3章 基于纳米金增强的SPR生物传感器检测癌胚抗原的研究38-50
• 3.1 前言38
• 3.2 实验部分38-43
• 3.2.1 实验仪器与试剂38-39
• 3.2.2 实验原理39-40
• 3.2.3 溶液的配制40-41
• 3.2.5 链霉亲和素修饰胶体金41-42
• 3.2.6 SA-GNPs的质量鉴定42
• 3.2.7 纳米金表面偶联链霉亲和素数目的测定42
• 3.2.8 胶体金增强的夹心法检测癌胚抗原42-43
• 3.2.9 选择性实验43
• 3.3 结果与讨论43-49
• 3.3.1 SA-GNPs的表征43
• 3.3.2 链霉亲和素与胶体金结合的最小蛋白量的确定43-44
• 3.3.3 纳米金表面偶联链霉亲和素数目及活性位点的测定44-45
• 3.3.4 bio-mAbCEA-B5与SA-GNPs的特异性结合45-46
• 3.3.5 SA-GNPs增强的夹心法检测缓冲溶液中癌胚抗原46-48
• 3.3.6 选择性实验48
• 3.3.7 回收率实验48-49
• 3.4 结论49-50
• 第4章 基于磁性微球的免疫荧光法对癌胚抗原的检测50-58
• 4.1 前言50
• 4.2 实验部分50-54
• 4.2.1 实验仪器与试剂50-51
• 4.2.2 溶液的配制51-52
• 4.2.3 免疫磁球的制备52
• 4.2.4 夹心荧光免疫分析法对CEA的检测52-53
• 4.2.5 选择性实验53-54
• 4.3 结果与讨论54-57
• 4.3.1 免疫结合时间选择54
• 4.3.2 洗涤次数对阴性对照的影响54-55
• 4.3.3 荧光显微检测与荧光强度分析55-57
• 4.3.4 选择性实验57
• 4.4 结论57-58
• 致谢58-59
• 参考文献59-66
• 攻读学位期间的研究成果66

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王佳颖;宁勇;刘湘;;表面等离子共振技术在抗原抗体相互作用中的研究[J];国际检验医学杂志;2015年05期

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中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 崔香;基于功能化纳米粒子的光学生物传感体系的研究[D];陕西师范大学;2013年

2 薛瑞;纳米材料电化学传感界面的构建及农药残留检测应用[D];北京工业大学;2014年

3 雷春阳;超电荷绿色荧光蛋白在生化传感中的研究与应用[D];湖南大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 姚桂红;基于纳米材料放大效应的表面等离子共振传感器的构建及其应用[D];南昌大学;2013年

2 张肖会;SPR传感器的构建及对敌敌畏和莠去津的快速检测[D];山东农业大学;2013年

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本文编号：1097215