血小板衍生生长因子C在高转移性乳腺癌中的转录后调控机制研究

发布时间：2017-10-26 07:41

  本文关键词：血小板衍生生长因子C在高转移性乳腺癌中的转录后调控机制研究

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【摘要】：血小板衍生因子C(PDGF-C)属于血小板衍生因子(PDGF)家族的一员。在正常细胞中PDGF-C仅有少量表达,而在癌症组织中,PDGF-C表达增加,且与肿瘤的增殖、转移密切相关。PDGF-C可介导细胞发生多种生物学行为,一般通过结合其受体PDGFα或β发挥生物学功能,有研究表明PDGF-C可以促进新生血管的形成,可促使肿瘤细胞发生转移和增殖。PDGF-C还是一类被大家所认可的可以激活成纤维细胞的细胞因子。在乳腺癌中,肿瘤组织中表达有大量的PDGF-C,且其表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关,而微环境中成纤维细胞上表达有PDGF-C的受体PDGFα和β,PDGF-C通过与其受体结合,激活受体,活化的受体导致酪氨酸激酶通路激活,介导成纤维细胞活化,参与多种细胞因子的分泌和细胞微环境的形成。越来越多的研究者认为肿瘤的增殖、转移及侵袭不仅取决于肿瘤细胞本身,而且取决于其所生长的微环境。肿瘤微环境由肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞及细胞外基质等构成。在乳腺癌中,高转移性乳腺癌患者基质组织中存在大量的活化的成纤维细胞,又称癌相关的成纤维细胞(CAFs)。作为肿瘤微环境的重要组成部分,CAFs与乳腺癌的进展息息相关,CAFs可以分泌多种因子介导乳腺癌的发生、发展,促进乳腺癌的浸润、增殖和转移。研究者们广泛认同的如SDF-1/CXCR4(基质细胞衍生因子1/基质细胞衍生因子受体4)生物轴,SDF-1/CXCR4是CAFs分泌的重要因子,CAFs通过分泌SDF-1/CXCR4促进肿瘤的定向转移和血管的生成。CAFs还可以通过分泌其他因子来促进肿瘤的增殖和转移,如肝细胞生长因子的(HGF),表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(b FGF),胰岛素样生长因子(IGF)等。CAFs是正常的成纤维细胞经过一些特定的细胞因子的刺激,使之成为活化的成纤维细胞(CAFs)。因此阻断肿瘤微环境中CAFs的活化过程能阻断肿瘤的发展过程。PDGF-C通过与其受体结合介导成纤维细胞的活化,因此降低PDGF-C的表达也可阻止成纤维细胞的活化。基因序列编码的蛋白最终得以表达需通过转录和翻译等过程。由于转录和翻译的复杂性,使人类的基因表达调控系统也在多个层面异常复杂。其中基因表达调控非常重要的一个环节就是转录后水平的调节。转录后水平调节的最重要的调节点之一就是m RNA的稳定性。Hu R是研究的最为成熟的一种RNA结合蛋白,分布于与多种组织中,包括乳腺、脾脏等,Hu R通过于m RNA 3’UTR区的AU富集元件结合激活其功能,增强m RNA的稳定性。根据本实验组前期的研究发现在高转移性乳腺癌中表达有大量的Hu R,而低转移性乳腺癌中Hu R的表达水平较低,文献也有类似的报道。我们通过生物信息学分析发现在PDGF-C m RNA的3’UTR区存在5个AU富集元件,可能是Hu R的结合位点。构建PDGF-C m RNA的3’UTR区载体,转染入Hu R高表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,双荧光素酶基因报告系统检测发现Hu R可明显的增加荧光素酶基因的表达,且在第2个和第4个结合位点基因表达增长较明显,由此可知Hu R可作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区调节PDGFC。在MDA-MB-231细胞中,通过si RNA降低Hu R的表达,用western blot技术检测在Hu R不同表达水平下PDGF-C表达水平的变化,研究发现利用si RNA降低Hu R的表达后,PDGF-C的表达也降低。说明Hu R可以调节PDGF-C的表达,且为正向调节。微小RNA(mi R)也是通过转录后水平调节来调节蛋白的表达。mi R是一类小的非编码RNA分子,贯穿癌症的整个发生、发展过程,多与原癌基因或抑癌基因相关。mi R一般通过结合靶基因m RNA的3’UTR区,降解靶基因的m RNA,从而降低靶基因编码蛋白的表达。本研究通过生物信息学分析找出可能作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区的mi R,通过与PDGF-C m RNA的3’UTR的荧光载体共同转染入MDA-MB-231细胞中,培养48小时后,双荧光素酶基因报告系统验证有生物学功能的mi R,研究发现在分析软件分析出的17种mi R只有mi R-382-5p降低读数最明显;将mi R-382-5p类似物转染入MDA-MB-231细胞中,用western blot技术检测PDGF-C的表达变化,结果发现MDA-MB-231细胞转染入mi R-382-5p类似物后PDGF-C的表达降低。这就证明mi R-382-5p可以作用于PDGF-C m RNA的3’UTR区,降解PDGF-C的m RNA,使PDGF-C表达下调。同时我们利用RT-PCR技术检测恶性程度不同的两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MCF-7细胞中mi R-382-5p表达情况,结果显示在转移性高的MDA-MB-231细胞中mi R-382-5p表达低,而在转移性低的MCF-7细胞中mi R-382-5p表达高,符合前面实验结果的逻辑。Hu R和mi R-382-5p都可以作用于PDGF-C的3’UTR区,且同时存在与乳腺癌肿瘤组织中。将乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞分为3组,第1组MDA-MB-231细胞正常培养,第2组给细胞内转染mi R-382-5p类似物,第3组转染Hu R的si RNA,western blot实验检测PDGF-C的表达差异。研究发现PDGF-C在第一组表达最高,第二组稍有降低,第三组显著降低,说明Hu R和mi R-382-5p都可在转录后水平调节PDGF-C的表达,且分别为正向和负向调节。在高转移性乳腺癌中,PDGF-C可激活肿瘤微环境中的成纤维细胞,进而促进肿瘤的增殖、转移。本研究设计一系列实验,发现RNA结合蛋白Hu R可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR区,上调PDGF-C的表达,而mi R-382-5p可作用于PDGF-C m RNA 3’UTR区,但降低PDGF-C的表达。使我们对乳腺癌的增殖、转移调节机制的研究有了新的方向。
【关键词】：PDGF-C 乳腺癌 肿瘤微环境 转录后调控 miR HuR
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 文献回顾12-18
• 实验一18-33
• 1 实验材料18-19
• 2 实验方法19-25
• 3 实验结果25-28
• 4 讨论28-33
• 实验二33-45
• 1 实验材料33
• 2 实验方法33-36
• 3 实验结果36-38
• 4 讨论38-45
• 小结45-46
• 参考文献46-54
• 个人简历和研究成果54-55
• 致谢55-56

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈志强;尹凌帝;孙倩;刘博巽;秦宇;孙明;德伟;刘志军;;长链非编码RNA BANCR对非小细胞肺癌增殖和侵袭的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2015年05期

2 屈亚琦;罗年安;王涛;贾林涛;董瑞;;PDGF-C 3'UTR区荧光素酶报告基因载体构建[J];现代生物医学进展;2015年20期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李建;CXCL12-CXCR7轴在胰腺癌迁移侵袭中的作用及机制研究[D];北京协和医学院;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 宋燕燕;STAT3和CXCR3对胃腺癌组织中血管生成拟态的作用及其临床病理意义的研究[D];山东大学;2014年

2 潘良彬;CCR7蛋白在非小细胞肺癌中表达的意义及与CXCR4蛋白表达的相关性[D];苏州大学;2014年

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本文编号：1097718