阿霉素耐药Raji细胞株的建立与Prohibitin及微小RNA-27a的表达情况分析

发布时间：2017-10-28 06:37

  本文关键词：阿霉素耐药Raji细胞株的建立与Prohibitin及微小RNA-27a的表达情况分析

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【摘要】：研究背景：非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)是起源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤,其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种免疫细胞恶变有关。NHL可分为B细胞性和T细胞性,其中B细胞性占大多部分,包括弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、Bukitt淋巴瘤(BL)等。目前,联合化疗CHOP(环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+强的松)方案仍是治疗大多数NHL患者的主要措施。然而,随着化疗药物的广泛应用,NHL多药耐药(MDR)性问题已成为治疗失败的一个重要原因。已知肿瘤MDR机制复杂,涉及多种耐药相关基因及其耐药相关蛋白表达的改变以及多种信号通路的激活,其产生的机制可能有：药物外排增加、细胞凋亡调节障碍、药物作用靶标改变、DNA损伤修复功能增强、药物代谢动力学改变等。因此,研究针对MDR相关基因、蛋白与信号通路的靶向药物和开发有效的多药耐药逆转剂已成为近年来国内外学者的研究热点。阿霉素(ADR)是一种经典的蒽环类抗生素,能嵌入DNA碱基对之间,并紧密结合到DNA上,阻止RNA转录过程,抑制RNA合成,也能阻止DNA复制,属于细胞周期非特异性药物。ADR抗瘤谱广,疗效高,是NHL联合化疗CHOP方案的重要药物。然而,ADR相关的心脏毒性反应和化学耐药性严重限制了其在NHL中的治疗效果,成为NHL治疗失败的一个重要原因。Burkitt淋巴瘤是一种高度侵袭性的NHL,目前临床治疗效果仍不理想,其体外建立的Burkitt淋巴瘤细胞系——Raji,一直以来被广泛应用于人B细胞淋巴瘤的研究中。通过建立一株体外ADR诱导的Raji耐药细胞株,进而寻找Raji耐药株与敏感株之间的差异表达基因与蛋白,从而发现与NHL耐药相关的新的靶标基因,将为进一步认识NHL耐药机制并探索有效的多药耐药逆转剂,最终战胜NHL临床耐药性难题提供有力支持。Prohibitin (PHB)是一类进化上高度保守,广泛存在于各种生物细胞中的蛋白,PHB基因家族可定位于线粒体、细胞核及细胞膜,其在细胞内的不同定位决定了它具有多样的生物学功能。人类PHB1和PHB2聚合形成高分子量环状复合体,主要定位于线粒体内膜,在维持线粒体呼吸链酶复合体及其形态和功能稳定性中发挥重要作用。目前在急性淋巴细胞白血病、卵巢癌、前列腺癌等多种人类恶性肿瘤中证实PHB通过调控线粒体膜功能在细胞抗凋亡中起保护性作用,从而在耐药机制中发挥重要作用。我们的前期研究亦发现,ADR处理Raji细胞后线粒体PHB表达上调,应用P13K/AKT通路抑制剂可以下调PHB的表达,并增加Raji细胞对ADR的化疗敏感性。由此我们推测PHB可能是与NHL多药耐药性的发生密切相关的一个靶标基因。微小RNA (miRNA)是广泛存在于真核生物中由20-23个核苷酸组成的的单链小分子RNA,通过抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA两种方式在转录后水平调节基因的表达,参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学功能的调控,从而影响疾病的发生发展,成为潜在的治疗靶标及新的分子生物学标志物。miRNA在肿瘤细胞MDR中的作用已日益引起了国内外关注,而大量研究也已证实,多种miRNAs在NHL细胞中存在表达水平的改变,通过调节不同靶标基因蛋白的表达,调控淋巴细胞的分化、发育与凋亡,进而影响NHL的诊疗和预后。以miRNA作为切入点设计基因药物将为NHL的靶向基因治疗,改善NHL细胞耐药性开辟一条新的途径。研究发现,微小RNA-27a (miR-27a)在多种肿瘤中高表达,并发挥原癌基因的作用。此外,miR-27a高表达还与急性白血病、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤细胞多药耐药的发生密切相关,其表达水平的改变可通过改变多药耐药基因的表达水平在白血病、胃癌及食管癌细胞对多柔比星的药物抵抗中发挥重要作用。因此,我们推测miR-27a可能是参与NHL多药耐药机制的另一个重要靶标基因。目前国内外还未见PHB与miR-27a与NHL多药耐药性相关的报道。本研究中,我们通过建立ADR耐药的Raji细胞株,并检测ADR耐药细胞株及其敏感株中PHB及miR-27a的表达水平差异,从线粒体蛋白及miRNA的角度阐述与ADR作用密切相关的新的NHL耐药分子靶标,为逆转NHL细胞多药耐药提供新的治疗靶点。研究目的：建立阿霉素(ADR)耐药Raji细胞株,并检测Prohibitin(PHB)及微小RNA-27a (miR-27a)在耐药细胞株(Raji/A)及敏感细胞株(Raji/S)中的表达差异并探讨其临床意义。研究方法：建立Raji/A细胞株,相差显微镜观察细胞一般形态及生长特性并计数,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Raji/A及Raji/S细胞中miR-27a与PHB基因mRNA的表达水平,Western blot检测PHB1蛋白在Raji/A及Raji/S细胞线粒体中的表达。研究结果：建立了Raji/A细胞株,其一般形态及生长特性与Raji/S细胞株相比出现差异,增殖速度减慢,耐药倍数为306.47倍,对长春新碱(VCR)、高三尖杉酯碱(HHT)存在交叉耐药,耐药倍数分别为3.44倍和2.88倍,对甲氨蝶呤(MTX)无交叉耐药性,脱药培养1个月仍保持耐药性,经ADR处理后凋亡明显减少。miR-27a在Raji/A细胞中的表达明显高于Raji/S细胞,为(128.40±31.59)倍(P0.05); PHB1基因mRNA在Raji/A细胞中的表达明显高于Raji/S细胞,为(7.66±3.27)倍(P0.05)；PHB2基因mRNA在Raji/A细胞中的表达是Raji/S的(1.25±0.47)倍,差异无统计学意义(P0.05); PHB1蛋白在Raji/A细胞的表达量明显高于Raji/S细胞。研究结论：成功构建稳定Raji/A细胞模型,PHB1及miR-27a在Raji/A细胞中高表达可能参与Raji细胞ADR耐药机制。
【关键词】：Raji 阿霉素 耐药 Prohibitin 微小RNA-27a
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-26
• 结果26-28
• 讨论28-30
• 结论30-31
• 附表31-33
• 附图33-35
• 参考文献35-37
• 综述37-65
• 参考文献52-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表的学术论文66-67
• 学位论文评阅及答辩情况表67

【参考文献】

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1 唐娟;曹兰琴;易红;汤参娥;;Prohibitin蛋白与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的初步研究[J];中南大学学报(医学版);2012年12期

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本文编号：1107091