MDM2的N端结构域和中央结构域的原核表达及蛋白纯化

发布时间：2017-10-29 02:22

  本文关键词：MDM2的N端结构域和中央结构域的原核表达及蛋白纯化

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【摘要】：MDM2为小鼠双微体基因,是RING家族的泛素化E3连接酶,其主要的生物学作用有增强细胞的生存活力和延长细胞生存期。研究表明,MDM2参与人类肿瘤的发生发展以及在细胞周期调节中的重要作用使其成为肿瘤研究的兴趣点之一。p53是一个重要的抑癌蛋白,能够维持基因组的完整性,通过引起细胞周期阻滞和凋亡来应答细胞阻力。正常生理情况下,p53表现出低水平,当细胞受到外界刺激后,p53表现出高水平并且稳定性增强,进而参与细胞衰老、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的生命过程。p53过度表达或不当的激活均能使细胞死亡,而表达减少或失活则导致肿瘤的发生。然而,p53在大多数人类癌症中表现为突变或功能失活,这就为基于p53的激活提供了一个很有吸引力的肿瘤治疗策略,虽然临床已经批准,但p53活化剂的研制仍然未能实现。MDM2抑癌的机制则为MDM2蛋白是重要的p35功能负性调节因子之一,通过与抑癌基因p53结合,介导p53泛素化蛋白水解酶途径的降解。而对于MDM2的N端部分结构域、锌指结构域以及中央结构域(锌指结构域酸性结构域)是否是p53的主要结合部位,至今没有相关报道,因此,着重对MDM2这些结构域的生物学研究对肿瘤预防具有重要的生物学意义。本实验的目的是构建含His-sumo标签的重组质粒以得到融合蛋白。方法是利用PCR技术从MDM2基因文库中扩增出MDM2的N端部分结构域、锌指结构域以及中央结构域基因的编码序列,插入pp SUMO载体中得到重组质粒,经酶切鉴定后转化大肠杆菌,挑选小量诱导出的重组质粒的菌落进行诱导表达并优化其表达条件,利用SDS-PAGE进行蛋白纯度及分子量分析,在前者的基础上经过了转膜及杂交等步骤,即用Western blot分析目的蛋白的表达量,待胶图得到单一目的条带时进行分子筛或离子交换分析其是否以单体状态存在。结果是重组质粒构建成功,转化到E.coli BL21中成功表达,经IPTG诱导后纯化目的蛋白,得到相对分子质量约为26k Da的N端部分结构域蛋白、约为21k Da的锌指融合蛋白和相对分子质量约为31k Da的中央结构域融合蛋白,为了切除SUMO标签故进行了ULP1蛋白酶的纯化。结论:本实验成功得到MDM2的N端部分结构域蛋白、锌指结构域蛋白和中央结构域蛋白,为后续的蛋白结晶和三维结构的研究奠定坚实基础。
【关键词】：MDM2的N端结构域 MDM2的锌指结构域 MDM2的中央结构域 原核表达 蛋白纯化
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R730.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第1章 绪论11-16
• 1.1 前言11-15
• 1.1.1 MDM2蛋白的结构12
• 1.1.2 MDM2的生物学功能12-13
• 1.1.3 MDM2与p53的关系13
• 1.1.4 MDM2与p53相互作用机制13-14
• 1.1.5 MDM2与p53的相互作用模式14
• 1.1.6 MDM2拮抗剂的研发14-15
• 1.2 技术路线15-16
• 第2章 MDM2的锌指结构域的构建及蛋白纯化16-47
• 2.1 实验仪器与材料16-18
• 2.1.1 实验仪器及设备16-18
• 2.1.2 试剂及材料18
• 2.2 常用试剂配置18-20
• 2.3 实验方法20-27
• 2.3.1 基因克隆20-24
• 2.3.2 诱导表达及蛋白纯化24-27
• 2.4 结果和讨论27-45
• 2.4.1 锌指结构域基因克隆27-29
• 2.4.2 锌指蛋白的诱导表达29-30
• 2.4.3 锌指融合蛋白的纯化30-45
• 2.5 讨论45-46
• 2.6 本章小结46-47
• 第3章 MDM2的中央结构域的原核基因表达及蛋白纯化47-62
• 3.1 概述47
• 3.2 实验仪器与试剂47
• 3.2.1 实验仪器及试剂配制47
• 3.3 实验方法47-49
• 3.3.1 基因克隆47-49
• 3.4 结果与讨论49-60
• 3.4.1 基因克隆与质粒构建49-54
• 3.4.2 蛋白纯化54-60
• 3.5 讨论60-61
• 3.6 本章小结61-62
• 第4章 MDM2的N端结构域的研究62-69
• 4.1 实验方法62-65
• 4.1.1 基因克隆62-65
• 4.2 实验结果65-67
• 4.3 讨论67-68
• 4.4 本章小结68-69
• 第5章 ULP1蛋白酶的制备69-77
• 5.1 ULP1概述69-70
• 5.2 课题设计与结果70-75
• 5.3 讨论75
• 5.4 本章小结75-77
• 第6章 总结与展望77-79
• 6.1 总结77
• 6.1.1 MDM2的锌指结构域、中央结构域及N端结构域的研究77
• 6.1.2 ULP1蛋白酶的纯化77
• 6.2 展望77-79
• REFERENCES79-85
• 致谢85-86
• 附录86-88

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本文编号：1111002