RNA结合蛋白HuR对乳腺癌细胞中PDGFC的转录后调控机制研究

发布时间：2017-10-30 05:00

  本文关键词：RNA结合蛋白HuR对乳腺癌细胞中PDGFC的转录后调控机制研究

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【摘要】：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率居女性恶性肿瘤之首,死亡率仅次于肺癌,就诊时大部分患者已发生转移,成为女性的“头号杀手”。乳腺癌发生发展是一个多因素参与的过程,其发病机制尚未完全清楚,但相关信号通路紊乱以及多基因表达失调是重要原因,因此研究乳腺癌演变过程中的基因表达,对于乳腺癌的诊治具有非常重要的理论意义和临床价值。血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF),其家族主要由PDGFA、B、C、D四个成员组成,它们通过形成异源二聚体或者自身相互作用,从而产生五种形式,即PDGF-AA、-AB、-BB、-CC和-DD。PDGF受体PDGFR-α和PDGFR-β在肿瘤细胞以及基质细胞中具有大量表达,当PDGF和其受体PDGFR-α、PDGFR-β结合时,能够激活下游信号,发挥其生物学功能。血小板衍生生长因子C(PDGFC)属于PDGF家族新成员,在多种组织细胞大量表达,包括乳腺癌在内的多种肿瘤细胞中亦广泛表达,最早发现于血小板α颗粒。肿瘤基质细胞成纤维细胞能够大量表达其受体,活化的受体通过激活酪氨酸激酶通路介导成纤维细胞活化,参与多种细胞因子的分泌以及肿瘤微环境的形成,有关PDGFC在肿瘤基质细胞中的作用机制研究相对较少。目前研究发现PDGFC在促进血管生成方面具有重要作用,过表达的PDGFC促进血管异常化,其表达在乳腺癌起始、发生及转移中发挥着显著作用。乳腺肿瘤细胞调节PDGFC表达的具体机制尚未清楚,深入探讨其调节机制,是认识乳腺癌发病机制的关键。人抗原R(human antigen R,Hu R)属于胚胎致死性异常视觉(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)基因家族成员,ELAV家族主要成员包括Hu R、Hu B、Hu C及Hu D四种,在细胞中,它们主要通过基因的转录后调节机制调节靶基因的表达。Hu R是ELAVL家族中研究的最为充分的m RNA结合蛋白,在机体组织细胞中广泛表达,主要定位于细胞核,在缺氧、炎性细胞因子等因素刺激下,其细胞质表达明显增高。近年来研究表明,Hu R蛋白是免疫细胞激活、肌肉分化、细胞分裂衰老等生命活动的重要调节基因,在转移性乳腺癌中高度活化。乳腺癌细胞中Hu R的过表达与肿瘤大小,组织分化及生存率等密切相关,我们的前期研究也表明,Hu R能够增强Snail的表达,促进乳腺肿瘤的转移。所有这些高度提示,Hu R有可能调节一些下游靶基因,通过一种自分泌或旁分泌的方式参与乳腺肿瘤的恶性转化。那么,在乳腺癌的发生发展过程中,Hu R是否调节PDGFC的表达?调节机制又是怎样呢?这是本研究所要解决的问题。越来越多的研究表明,转录后调控是通过某种RNA结合蛋白及mi RNA等介导实现的。在基因的表达调控中,转录后调控作为一种精细的调控模式在基因的表达以及细胞命运的决定中起着重要的作用。RNA结合蛋白Hu R通过与靶基因m RNA结合,在m RNA的加工、修饰、稳定性等方面发挥着重要作用,最终导致靶基因相关的生物学功能异常。本研究着眼于探讨PDGFC的调控机制。结合文献并通过生物信息学分析,我们发现PDGFC的3’端非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)具有Hu R的结合位点,提示PDGFC可能是Hu R调控的靶基因并受其转录后调节。基于以上假设,通过实时定量PCR、Western blot、RNA-IP、报告基因系统等实验明确了Hu R对PDGFC的分子调控机制,并进一步探讨了PDGFC在乳腺肿瘤发生发展及预后中的作用。本研究取得以下初步结论:1.PDGFC在乳腺癌组织和细胞中呈现高表达,并与患者预后及肿瘤细胞生物学行为相关。2.乳腺癌细胞中PDGFC和Hu R表达呈正相关。PDGFC的调控发生在转录后水平,软件预测分析发现,PDGFC 3’UTR存在Hu R的结合位点。3.Hu R通过与PDGFC m RNA 3’UTR结合上调PDGFC的表达。4.乳腺癌中应激诱导Hu R上调PDGFC。H2O2活化和紫外线(UV)照射乳腺癌细胞,诱导Hu R表达,从而上调PDGFC。综上所述,本课题组首次发现乳腺癌细胞中PDGFC和Hu R表达的相关性,深入探讨其调控机制发现,Hu R通过与PDGFC 3’UTR结合上调PDGFC,进而促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭。本研究揭示了Hu R在转录后水平上调PDGFC的分子机制,为乳腺癌的临床诊断和治疗提供了新的思路。
【关键词】：RNA结合蛋白 HuR 乳腺癌 PDGFC 转录后调控
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-24
• 乳腺癌概况16-17
• 一、乳腺癌的发病特点16
• 二、乳腺癌的诊断和治疗16-17
• PDGF 相关研究17-19
• 一、PDGF 及其受体17-18
• 二、PDGF 基本结构18-19
• 三、PDGF 生物学作用19
• PDGFC 相关研究19-21
• 一、PDGFC 及其受体19-20
• 二、PDGFC 变体20
• 三、PDGFC 生物学作用20-21
• HuR 相关研究21-23
• 一、Hu R 基本情况21-22
• 二、Hu R 作用机制22
• 三、Hu R 与肿瘤关系22-23
• 小结23-24
• 实验一 PDGFC在乳腺癌组织和细胞系中的表达24-37
• 1 材料、试剂和仪器24-26
• 1.1 实验材料24-25
• 1.2 主要试剂和仪器25-26
• 2 方法26-31
• 2.1 PDGFC免疫组织化学检测26-27
• 2.2 乳腺癌细胞培养27
• 2.3 蛋白印迹法（Western blot）27-29
• 2.4 si RNA（PDGFC）转染29
• 2.5 MTT实验29-30
• 2.6 侵袭实验30
• 2.7 统计学方法30-31
• 3 结果31-35
• 3.1 PDGFC在乳腺癌组织中的表达31-34
• 3.2 PDGFC在乳腺癌细胞系中的表达34-35
• 3.3 PDGFC表达下调对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和侵袭的影响35
• 4 讨论35-37
• 实验二 乳腺癌细胞中PDGFC和Hu R表达的相关性37-43
• 1 材料、试剂和仪器37-38
• 1.1 实验材料37
• 1.2 主要试剂和仪器37-38
• 2 方法38-40
• 2.1 PDGFC启动子活性分析38-39
• 2.2 PDGFC 3’UTR活性分析39
• 2.3 预测PDGFC 3’UTR的Hu R结合位点39
• 2.4 Hu R免疫组织化学检测39-40
• 2.5 统计学方法40
• 3 结果40-42
• 3.1 不同乳腺癌细胞系PDGFC启动子和PDGFC 3’UTR报告基因活性检测40-41
• 3.2 预测PDGFC 3’UTR的Hu R结合位点41
• 3.3 Hu R在乳腺癌组织中的表达41-42
• 4 讨论42-43
• 实验三 乳腺癌细胞中Hu R调控PDGFC的分子机制43-51
• 1 材料、试剂和仪器43-44
• 1.1 实验材料43
• 1.2 主要试剂和仪器43-44
• 2 方法44-47
• 2.1 Western blot检测不同乳腺癌细胞系中Hu R和PDGFC的表达44
• 2.2 si RNA(Hu R)转染44-45
• 2.3 RNA提取及定量45
• 2.4 反转录45
• 2.5 实时定量PCR45-46
• 2.6 RNA免疫共沉淀(RNA-IP)46
• 2.7 截短PDGFC 3’UTR和si-Hu R2干预后，报告基因活性检测46-47
• 3 结果47-49
• 3.1 PDGFC和Hu R在不同乳腺癌细胞系中的表达47
• 3.2 si RNA对乳腺癌细胞Hu R表达的影响47-48
• 3.3 实时定量PCR分析si-Hu R2干扰PDGFC的表达48
• 3.4 RNA-IP证实Hu R与PDGFC m RNA的直接相互作用48-49
• 3.5 PDGFC m RNA 3’UTR报告基因系统检测49
• 4 讨论49-51
• 实验四 乳腺癌中应激诱导Hu R调控PDGFC51-56
• 1 材料、试剂和仪器51-52
• 1.1 实验材料51
• 1.2 主要试剂和仪器51-52
• 2 方法52-53
• 2.1 Western blot检测经H2O2活化后MCF-7 细胞中Hu R和PDGFC的表达52
• 2.2 Western blot检测经紫外线照射后MCF-7 细胞中Hu R的表达52
• 2.3 ELISA检测经紫外线照射后MCF-7 细胞中PDGFC的表达52
• 2.4 MCF-7 细胞活性检测（MTT实验）52-53
• 3 结果53-54
• 3.1 H2O2诱导Hu R上调PDGFC53
• 3.2 紫外线诱导Hu R上调PDGFC53-54
• 3.3 不同处理条件对MCF-7 细胞活性的影响54
• 4 讨论54-56
• 小结56-57
• 参考文献57-74
• 个人简历和研究成果74-75
• 致谢75

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