ABCG2特异性人源肺腺癌噬菌体单链抗体的制备及化疗增敏和放免显像研究

发布时间：2017-10-30 07:28

  本文关键词：ABCG2特异性人源肺腺癌噬菌体单链抗体的制备及化疗增敏和放免显像研究

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【摘要】：目的:利用噬菌体展示肽库技术制备并筛选出ABCG2特异性全人源肺腺癌噬菌体单链抗体,验证其免疫学活性、增值抑制和顺铂增敏作用,放射性核素标记抗体后进一步行裸鼠体内放免显像研究,为临床肺腺癌的化疗耐药逆转和分子靶向治疗提供理论和实验依据。方法与结果:第一部分单链抗体库的构建1.ScFv基因的合成:以肺腺癌患者癌旁阳性淋巴结为组织来源,提组织总RNA。逆转录合成cDNA,PCR扩增VH和VL基因片段。以VH和VL为模板继续PCR,分别在其上下游加上Linker序列。等摩尔量的VH-Linker-和Linker+-VL片段经SOE-PCR拼接成scFv片段。1%琼脂糖凝胶电泳验证RCR产物大小并切胶回收各产物片段。结果显示:提取的组织总RNA纯度较好无降解,A260/A280比值达1.98;VH、VL、VH-Linker-、Linker+-VL及scFv产物大小分别为360 bp、340 bp、410 bp、390 bp和750 bp,大小与预期相符。2.初级抗体库的制备:纯化的scFv片段经Sfi I和Not I双酶切后到与噬菌体表达载体pcantab5e连接。连接产物电转化至感受态大肠杆菌tg1。质粒pcr结果显示scfv片段阳性插入率达100%(12/12),双酶切鉴定正确,阳性质粒行测序验证,序列比对结果与整码的scfv编码序列一致性可达99%。3.噬菌体抗体的表达:2×yt培养液收集含阳性质粒的平板,利用m13ko7辅助噬菌体感染诱导scfv片段的融合表达。第二部分单链抗体的筛选、纯化及免疫活性检测1.a549肺腺癌细胞和abcg2纯化抗原对抗体库的联合筛选:以a549细胞先对初级抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的全细胞筛选,再用abcg2抗原进行3轮固相筛选。经过6轮筛选,抗体库效价由首轮1.54×10-6逐轮提升至1.7×10-4,滴度提升约110倍。2.单链抗体scfv的可溶性表达和免疫活性鉴定:将噬菌体elisa验证呈阳性的噬菌体抗体感染e.colihb2151,iptg诱导scfv可溶性表达。经hitraptmanti-etag亲和层析柱纯化后行sds-page电泳鉴定,同时以抗e-tag抗体为一抗(1:3,000)行western-blot检测,结果显示在34kda处有一条清晰的条带。以非靶向scfv为对照,elisa和免疫细胞化学检测scfv的特异性发现该scfv与肺腺癌a549细胞的结合具有相对特异性。竞争elisa结果显示,当抗体1:500稀释时,scfv对igg的结合抑制率为4.56%±1.96%;1:1稀释时,结合抑制率增加到68.09%±4.27%,表明该scfv对a549细胞具有较高的亲和力。第三部分单链抗体的增殖抑制及化疗增敏实验1.cck-8、克隆形成、迁移实验及流式细胞术:单链抗体scfv处理a549细胞48h后进行cck-8增殖实验分析发现scfv对细胞增殖呈时间依赖性抑制。克隆和迁移实验表明scfv能够明显抑制a549细胞的集落形成和穿膜能力。凋亡和周期结果显示,scfv诱导a549细胞凋亡率明显增加(47.95%±5.43%vs.9.21%±2.38%,p0.01),且细胞周期阻滞于g1期(70.70%±1.81%vs.52.44%±2.72%,p0.01)。2.单链抗体对肺腺癌细胞的化疗增敏作用:a549细胞经scfv处理后对顺铂的敏感性明显增加,ic50值(5.31±0.49μg/mlvs.0.06±0.03μg/ml)随scfv剂量增加而减小。3.单链抗体调节耐药蛋白表达:a549细胞经不同剂量scfv处理后,提取细胞总蛋白,行westernblot检测。结果表明scfv能够明显下调abcg2蛋白表达,且对abc家族的其他成员mdr1也有一定的协同抑制作用。第四部分单链抗体的放免显像研究采用氯胺t法对单链抗体scfv进行放射性核素131i的标记。标记后的scfv经尾静脉注射至荷人肺腺癌裸鼠体内,测定不同时间点裸鼠体内肿瘤及其他各组织%id/g(每克组织百分注射剂量率),并行spect/ct显像。结果显示:注射131i-scfv后,裸鼠体内各组织对抗体的摄取量逐渐增加,以肿瘤组织最明显,相应的瘤/血、瘤/肌肉、瘤/脑的放射性比值呈逐渐升高趋势并在第24h达到峰值(3.45±1.06、4.51±0.89和23.65±3.00),随后逐渐降低。spect/ct融合显像发现肿瘤部位具有相对特异性的放射性聚集,以第24h显像最清楚。第五部分单链抗体的体内抗肿瘤活性检测新鲜分离的A549细胞(2×106/100μL PBS)皮下注射至裸鼠背部,当肿瘤生长至约500 mm3左右时,将裸鼠随机分为四组:生理盐水NS组、单抗scFv组、顺铂DDP组和scFv+DDP联合组(scFv 10 mg/kg,i.p.,d1-3 and DDP 2.5 mg/kg,i.p.,d 4,7.),观察两组肿瘤体积变化情况。收集肿瘤组织,石蜡包埋切片,以Ki-67和cleaved caspase 3抗体行免疫组化染色以检测增殖和凋亡。结果显示scFv+DDP联合组瘤体明显小于对照组且具有明显增加的cleaved caspase 3和降低的Ki-67表达。结论:本研究以噬菌体展示肽库技术为基础,制备并筛选出ABCG2特异性全人源肺腺癌噬菌体单链抗体,检测抗体的免疫活性、化疗增敏和体内外增殖抑制作用,并经放射性核素标记后进一步行体内分布研究及放免显像研究。结果表明成功筛选出ABCG2特异性人肺腺癌单链抗体,具有较高亲和力和特异性,能够有效抑制肺腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡并增加顺铂敏感性。经放射性核素标记的单链抗体显示出良好的动力学特征,对靶组织的亲和力高,具有较满意的放免显像效果,能够为今后深入研究肺腺癌的放免诊断、靶向治疗提供实验基础。
【关键词】：肺腺癌 ABCG2 ScFv 化疗增敏 放免显像
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-18
• 1 材料18-22
• 2 方法22-30
• 3 结果30-32
• 4 讨论32-34
• 全文总结34-35
• 参考文献35-37
• 附图表37-42
• 文献综述42-51
• 参考文献47-51
• 致谢51-52
• 硕士期间发表的论文52

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本文编号：1116704