DND1与GRN相互作用的鉴定

发布时间：2017-10-30 19:05

  本文关键词：DND1与GRN相互作用的鉴定

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【摘要】：背景:Dnd1基因在小鼠雄性生殖细胞发生和睾丸生殖细胞瘤发生中有重要作用,但其作用机制及其与人类疾病关系仍未明了。在前期工作中,我们已通过酵母双杂交技术筛选到四个与人DND1相互作用的蛋白,它们分别是GRN、FLAD1、RNF31、EFEMP1。其中Grn基因在调节细胞生长、损伤修复和肿瘤的发生中起重要作用。由于酵母双杂交系统的筛选存在假阳性结果,为此我们利用免疫共沉淀、GST pull-down及细胞内共定位的方法验证DND1与GRN的相互作用。我们可通过验证Grn和Dnd1的相互作用,来找出它们之间的联系,为进一步阐明Dnd1的生物学功能奠定基础。实验目的:验证DND1与GRN的相互作用。实验方法:(1)用PCR的方法扩增Dnd1片段,通过酶切与连接,将Dnd1片段构建到原核表达载体pET32a和真核表达载体pCDNA3.1-myc-his,pemRFP-C1上,再转化入感受态细胞TOP10,菌液PCR鉴定阳性克隆并测序分析;(2)从人单核细胞系THP-1细胞cDNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到原核表达载体pGEX-4T-2和真核表达载体pemGFP-C1上,再转化入感受态细胞TOP10,菌液PCR鉴定阳性克隆并测序分析;(3)通过细胞内共定位的方法,确定GRN与DND1在细胞内相互作用的亚细胞位置;(4)利用免疫共沉淀技术,验证DND1与GRN真核表达产物细胞内是否具有相互作用;(5)利用GST pull-down技术,验证GRN与DND1原核表达产物细胞外是否具有相互作用。实验结果:(1)成功构建人Dnd1原核表达和真核表达的重组载体:pET32a-dnd1,pCDNA3.1-myc-his-dnd1和pemRFP-C1-dnd1;(2)成功构建人Grn原核表达和真核表达的重组载体:pGEX-4T-2-grn和pemGFP-C1-grn;(3)细胞内共定位实验结果表明GRN与DND1在细胞质中有明显的共定位;(4)免疫共沉淀试验证实DND1与GRN在真核细胞内具有相互作用;(5)GST pull-down试验结果表明DND1与GRN在体外具有相互作用。实验结论:利用细胞内共定位实验、免疫共沉淀和GST pull-down试验证实GRN与DND1具有相互作用,为继续深入研究Dnd1基因信号传导通路及其生物学功能奠定基础。
【关键词】：人Dnd1基因 人Grn基因 基因克隆 共定位 免疫共沉淀 GST pull-down
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1.引言10-15
• 1.1 人Dnd110
• 1.2 人Grn10-11
• 1.3 蛋白质相互作用技术11-15
• 2.实验材料15-22
• 2.1 试验仪器15-16
• 2.2 质粒、菌株和细胞株16
• 2.3 主要材料16-17
• 2.4 试剂17-22
• 3.实验方法22-47
• 3.1 Dnd1原核表达和真核表达重组载体的构建22-30
• 3.2 Grn原核表达和真核表达重组载体的构建30-36
• 3.3 293T细胞培养36-37
• 3.4 细胞转染37-39
• 3.5 细胞共定位39-40
• 3.6 免疫共沉淀40-44
• 3.7 GST pull-down44-47
• 4. 实验结果47-62
• 4.1 Dnd1原核表达和真核表达重组载体的构建47-52
• 4.2 Grn原核表达和真核表达重组载体的构建52-57
• 4.3 细胞共定位57-58
• 4.4 免疫共沉淀58-60
• 4.5 GST Pull-down60-62
• 5. 讨论62-66
• 6. 结论66-67
• 参考文献67-72
• 综述72-86
• 参考文献80-86
• 主要缩写词表86-88
• 攻读硕士学位期间的主要成果88-89
• 致谢89-90

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1 谌思;DND1与GRN相互作用的鉴定[D];湖南师范大学;2015年

2 刘博;拟南芥DND1、DND2基因及DND1启动子的克隆和载体构建[D];内蒙古农业大学;2012年

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本文编号：1118894