HBV编码HBV-miR-2通过下调SMAD4促进肝癌细胞恶性行为

发布时间：2017-10-31 01:29

  本文关键词：HBV编码HBV-miR-2通过下调SMAD4促进肝癌细胞恶性行为

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【摘要】：目的:肝细胞肝癌(HCC)是目前最常见的肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。目前研究表明HCC的发生受到多种高危因素的影响,其中乙型肝炎病毒(HBV)的感染占到了肝癌发病原因的80%。HBV持续性感染诱导的肝细胞肝癌是目前最常见的肝癌亚型,并且HBV相关肝癌的恶性程度较高,且其发展机制仍有待深入探索。研究表明细胞内的micro RNAs可以通过促进细胞的恶性行为的方式参与HCC的发展。然而,HBV本身是否编码miRNA且其在肝癌发展中发挥的作用还不清楚。为了解析HBV持续性感染诱导HCC发展的分子机制,本实验室利用solexa深度测序对HBV阴性和HBV阳性肝癌组织中差异表达的miRNA进行了分析,得到了一条与HBV基因组同源的约22nt的小片段miRNA分子,命名为HBV-miR-2。本研究拟验证HBV编码的HBV-miR-2的存在并探究其在肝癌细胞中的功能及作用机制。方法:为了确定HBV-miR-2的存在,通过RT-qPCR技术在HBV阳性的肝癌组织和血清样本中检测HBV-miR-2的表达;通过Northern blot技术在HBV阳性的Hep G2.2.15细胞中进一步确定HBV-miR-2的表达。然后,通过MTT、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验分析HBV-miR-2对肝癌细胞恶性行为的影响;为了解析HBV-miR-2的具体作用机制,我们利用生物信息学方法预测并结合相关的功能分析选定SMAD4作为HBV-miR-2的候选靶基因,并通过荧光报告载体实验、RT-q PCR和Western blot分析验证HBV-miR-2对SMAD4的靶定和调控作用。随后,我们分析了靶基因SMAD4对肝癌细胞恶性行为的影响,并利用挽救实验确定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因,从而阐明HBV-miR-2发挥作用的下游分子机制。结果:RT-qPCR检测结果表明HBV阳性的肝癌组织和血清样本中能够检测到HBV-miR-2,但是在HBV阴性肝癌组织和血清样本中没有检测到HBV-miR-2的存在。Northern blot实验在Hep G2.2.15细胞中能够检测到HBV-miR-2,但在Hep G2细胞中未检测到HBV-miR-2。功能性实验证实HBV-miR-2促进肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。荧光报告载体、RT-q PCR和Western blot实验表明HBV-miR-2直接靶定并负向调控SMAD4的表达。功能学实验表明SMAD4抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。挽救实验进一步确定SMAD4是HBV-miR-2的功能性靶基因。结论:本研究发现并验证了HBV编码的miRNA——HBV-miR-2的存在。HBV-miR-2能够促进肝癌细胞体内外生长转移恶性行为。SMAD4作为HBV-miR-2的直接的功能性靶基因,能够抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。
【关键词】：HBV miRNA 肝细胞肝癌 细胞增殖 侵袭 SMAD4
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、HBV编码HBV-miR-2的确定16-26
• 1.1 对象和方法16-22
• 1.1.1 实验材料16-17
• 1.1.2 实验方法17-22
• 1.2 结果22-25
• 1.2.1 HBV-miR-2的位置及二级结构22
• 1.2.2 HBV阳性肝癌组织中HBV-miR-2的表达22-23
• 1.2.3 HBV阳性血清样本中HBV-miR-2的表达23-24
• 1.2.4 Northern blot确定HBV阳性细胞中HBV-miR-2的存在24
• 1.2.5 不同肝癌细胞系中HBV-miR-2的表达24-25
• 1.3 讨论25
• 1.4 小结25-26
• 二、HBV-miR-2对肝癌细胞恶性行为的影响26-38
• 2.1 对象和方法26-32
• 2.1.1 实验材料26-27
• 2.1.2 实验方法27-32
• 2.2 结果32-36
• 2.2.1 HBV-miR-2过表达和封闭质粒的有效性验证32-33
• 2.2.2 HBV-miR-2促进肝癌细胞的生长33-34
• 2.2.3 HBV-miR-2促进肝癌细胞平板克隆形成34-35
• 2.2.4 HBV-miR-2抑制肝癌细胞凋亡35
• 2.2.5 HBV-miR-2促进肝癌细胞迁移和侵袭能力35-36
• 2.2.6 HBV-miR-2促进肝癌细胞上皮间质转化（EMT）36
• 2.3 讨论36-37
• 2.4 小结37-38
• 三、HBV-miR-2靶基因的确定38-43
• 3.1 对象和方法38-40
• 3.1.1 实验材料38
• 3.1.2 实验方法38-40
• 3.2 结果40-42
• 3.2.1 HBV-miR-2候选靶基因的预测40-41
• 3.2.2 HBV-miR-2直接靶定SMAD4的 3’UTR区41
• 3.2.3 HBV-miR-2抑制SMAD4的mRNA和蛋白表达41-42
• 3.3 小结42-43
• 四、SMAD4对肝癌细胞恶性行为的影响43-50
• 4.1 对象和方法43-45
• 4.1.1 实验材料43
• 4.1.2 实验方法43-45
• 4.2 结果45-49
• 4.2.1 SMAD4在不同肝癌细胞中的表达水平45-46
• 4.2.2 SMAD4过表达和敲降质粒有效性验证46-47
• 4.2.3 SMAD4抑制肝癌细胞的增殖能力47
• 4.2.4 SMAD4促进肝癌细胞凋亡47-48
• 4.2.5 SMAD4抑制肝癌细胞的迁移侵袭能力48-49
• 4.2.6 SMAD4抑制肝癌细胞的上皮间质转化（EMT）过程49
• 4.3 讨论49-50
• 4.4 小结50
• 五、SMAD4对HBV-miR-2恶性行为的挽救作用50-58
• 5.1 对象和方法51-53
• 5.1.1 实验材料51
• 5.1.2 实验方法51-53
• 5.2 结果53-56
• 5.2.1 SMAD4过表达能够挽救HepG2细胞中HBV-miR-2诱导的SMAD4低表达53-54
• 5.2.2 过表达SMAD4能够挽救HBV-miR-2诱导的HepG2细胞活性变化54
• 5.2.3 过表达SMAD4能够挽救HBV-miR-2诱导的HepG2细胞凋亡抑制54-55
• 5.2.4 过表达SMAD4能够挽救HBV-miR-2诱导的HepG2细胞迁移侵袭能力变化55
• 5.2.5 过表达SMAD4能够挽救HBV-miR-2诱导的HepG2细胞EMT变化55-56
• 5.3 讨论56-57
• 5.4 小结57-58
• 结论58-60
• 参考文献60-66
• 发表文章和参加科研情况说明66-67
• 附录67-68
• 综述 miRNA与HBV感染相关的疾病68-83
• 综述参考文献76-83
• 致谢83-84
• 个人简历84

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1 隋振华;HBV编码HBV-miR-2通过下调SMAD4促进肝癌细胞恶性行为[D];天津医科大学;2016年

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本文编号：1120229