C-myb原癌基因中G-四链体和i-motif结构的形成、性质和识别

发布时间：2017-10-31 04:12

  本文关键词：C-myb原癌基因中G-四链体和i-motif结构的形成、性质和识别

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【摘要】：人类端粒和原癌基因启动子区存在大量的重复序列,这些序列能够折叠成特殊的二级结构,存在的富G序列折叠成的二级结构被称作G-四链体,体外实验证明在生理条件的温度、pH、离子强度下,这些序列能够形成稳定的G-四链体结构,并且在细胞环境中运用适当的配体证明了该结构存在于哺乳动物细胞中,一些与G-四链体结构结合的的配体也被用来抑制端粒并控制原癌基因表达。基因组DNA中,富G序列对应的互补序列是富C序列,这些序列折叠形成的二级结构被称作i-motif,体外实验证明这些序列在生理条件的温度、离子强度和pH低于7的环境中能形成稳定的i-motif结构,其在体内细胞的存在性和作为细胞生物学化学介入靶标的可能性目前尚不确定,但是能够选择性与富C序列结合的蛋白质分离物仍激励了人们对i-motif结构生物作用的研究,因此,i-motif结构依然具有重要的研究意义。本文选取了C-myb原癌基因启动子区或启动子区附近富G序列和富C序列,通过电喷雾质谱(ESI-MS)和圆二色谱(CD)实验,探索了这些序列形成的G-四链体和i-motif结构及性质,并筛选出能与结构结合的配体。本实验的研究内容和结果如下：1.选取C-myb原癌基因启动子区上游富G序列S1为靶点,加上两端增加两个碱基的序列S2及其互补富C序列S3为研究对象,首先利用ESI-MS证明了S1和S2在NH4OAc溶液中形成了G-四链体结构,并发现S1在高浓度NH4OAc中能形成二聚体结构而S2不会；进一步用CD实验证明了S1和S2在不同浓度的NH4OAc和KCl溶液中形成了平行链构型的G-四链体；用ESI-MS筛选出了对S1G-四链体有高亲和力和选择性的小分子配体马钱子碱,该分子在含有短链双螺旋和基因组双螺旋结构的情况下依然对S1 G-四链体具有选择性;最后利用CD升温,质谱升温和二级串联质谱实验证明小分子的结合对结构稳定性具有促进作用。2.选取C-myb原癌基因启动子区下游富G序列S4为靶点,首先利用ESI-MS证明了S4在NH4OAc溶液中形成了G-四链体结构,并用CD实验验证了质谱的结论,发现S4在不同浓度的NH4OAc和KC1溶液中形成了平行／反平行链混合的G-四链体构型；接下来利用CD实验研究了不同浓度NH4+、K+和甲醇对G-四链体结构的影响,发现NH4+、K+促进溶液中G-四链体结构含量增加,甲醇含量增加促进结构中平行链结构转化为反平行结构；接下来筛选出对S4 G-四链体有高亲和力和选择性的小分子原阿片碱,并利用二级串联质谱证明了小分子的结合能促进结构的稳定。3.选取C-myb原癌基因启动子区富C序列S5和S6为靶点,加上S6的互补序列S7为研究对象,首先利用ESI-MS和CD实验证明了pH4.5的酸性溶液条件下序列能形成i-motif结构；探索了溶液条件改变对结构的影响,发现NH4OAc浓度和CH3OH含量不影响结构,但是能改变质谱的信噪比,对结构的主要影响因素是溶液的pH及拥挤条件；研究了两条序列在一系列不同pH的PBS溶液中的CD谱图和升温谱图发现,酸性条件不仅能够促进i-motif结构的形成也有利于提高结构的稳定性；利用ESI-MS筛选了对结构有亲和力的小分子防己诺林碱,并研究了不同溶液环境下S6与它的互补链的竞争实验。
【关键词】：电喷雾质谱 G-四链体 i-motif 天然产物小分子 特异性识别
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第1章 绪论10-27
• 1.1 引言10
• 1.2 G-四链体和i-motif结构的生物学意义10-16
• 1.2.1 G-四链体和i-motif的结构10-12
• 1.2.2 G-四链体和i-motif结构形成和稳定性的影响因素12-13
• 1.2.3 G-四链体结构在生物体内的存在及功能13-16
• 1.3 G-四链体与i-motif的配体分子16-23
• 1.3.1 G-四链体的配体分子16-22
• 1.3.1.1 π-π堆积作用分子16-20
• 1.3.1.1.1 吖啶衍生物16-17
• 1.3.1.1.2 卟啉衍生物及其类似物17-18
• 1.3.1.1.3 喹啉衍生物18-19
• 1.3.1.1.4 异喹啉及其衍生物19
• 1.3.1.1.5 端粒霉素及其类似物19-20
• 1.3.1.2 沟区/loop区作用分子(偏端霉素A及其衍生物)20-21
• 1.3.1.3 与G-四分体中心结合的分子(部分蒽醌及其类似物)21-22
• 1.3.2 i-motif结构的配体分子22-23
• 1.4 C-myb基因的生物功能23-24
• 1.5 G-四链体的研究手段24-26
• 1.6 本课题的基本思路和目的26-27
• 第2章 C-myb中S1 G-四链体的形成、性质及与马钱子碱的结合27-41
• 2.1 引言27
• 2.2 实验仪器与试剂27-28
• 2.2.1 实验仪器27
• 2.2.2 实验试剂27-28
• 2.3 实验方法28-29
• 2.3.1 各储备液的配制28
• 2.3.2 电喷雾质谱溶液配制及实验方法28
• 2.3.3 圆二色谱溶液配制及实验方法28-29
• 2.4 结果与讨论29-40
• 2.4.1 G-四链体结构的形成及性质29-31
• 2.4.2 S2末端碱基对G-四链体结构的影响31-33
• 2.4.3 几种生物碱分子与G-四链体的结合亲和力33-35
• 2.4.4 马钱子碱与G-四链体的结合选择性35-37
• 2.4.5 G-四链体和双螺旋结构与马钱子碱结合的竞争实验37-38
• 2.4.6 G-四链体和与马钱子碱结合的复合物的热稳定性38-40
• 2.5 结论40-41
• 第3章 C-myb中S4 G-四链体的形成、性质及与原阿片碱的结合41-53
• 3.1 引言41
• 3.2 实验仪器与试剂41-42
• 3.2.1 实验仪器41-42
• 3.2.2 实验试剂42
• 3.3 实验方法42-43
• 3.3.1 各储备液的配制42
• 3.3.2 电喷雾质谱溶液配制及实验方法42
• 3.3.3 圆二色谱溶液配制及实验方法42-43
• 3.4 结果与讨论43-52
• 3.4.1 C-myb基因中G-四链体结构的形成43-44
• 3.4.2 影响G-四链体结构和稳定性的因素44-46
• 3.4.3 S4与小分子原阿片碱的结合46-47
• 3.4.4 小分子原阿片碱与S4 G-四链体结合的选择性47-49
• 3.4.5 结合小分子后对G-四链体结构及稳定性的影响49-52
• 3.5 结论52-53
• 第4章 C-myb启动子区i-motif结构的形成、性质和识别53-67
• 4.1 引言53-54
• 4.2 实验仪器与试剂54
• 4.2.1 实验仪器54
• 4.2.2 实验试剂54
• 4.3 实验方法54-55
• 4.3.1 各储备液的配制54
• 4.3.2 电喷雾质谱溶液的配制及实验方法54-55
• 4.3.3 圆二色谱溶液的配制及实验方法55
• 4.4 结果与讨论55-66
• 4.4.1 C-myb基因中富C序列的i-motif结构的形成55-56
• 4.4.2 影响i-motif结构形成的因素56-63
• 4.4.3 S6序列形成的i-motif结构的稳定性63-64
• 4.4.4 i-motif结构与小分子的结合64-65
• 4.4.5 富C链与其互补链在不同溶液中形成的结构65-66
• 4.5 结论66-67
• 参考文献67-79
• 攻读硕士期间的主要科研成果79-80
• 致谢80

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本文编号：1120715