VPS33B抑制肺癌细胞增殖，迁移和侵袭

发布时间：2017-11-01 15:12

  本文关键词：VPS33B抑制肺癌细胞增殖，迁移和侵袭

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【摘要】：研究背景原发性支气管肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一,也是全球与癌症相关死亡率最高的癌症之一,它原发于支气管黏膜和肺泡。现在研究认为导致肺癌的主要原因与吸烟、环境严重污染和氡暴露等有关。在全球男性癌症患者中肺癌是最主要的死亡原因,而在发展中国家肺癌也成为了女性癌症患者中仅次于宫颈癌的第二大死亡因素。全球每年超过100万人死于肺癌并且肺癌的死亡率仍然在以每年1-5%的速度逐年递增,在发展中国家中这一趋势尤为突出,我国肺癌发病率和死亡率仍呈迅速上升的趋势,每年发病率约增长26.9%。由于肺癌在早期起病隐匿,症状不明显,当发现并诊断为肺癌时已经处于疾病进展期,大部分肺癌患者在得到明确诊断以前已经开始出现侵袭及转移现象,尽管经过几十年对肺癌发病机制的不断研究,现在也已产生多种治疗肺癌的方法,但目前肺癌的5年生存率仍然小于15%,因此提高肺癌的存活率已成为当前最紧迫的目标也是最艰难的挑战。根据组织学分类,肺癌现在主要分为两大类：小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中约15%的肺癌患者属于小细胞肺癌,非小细胞肺癌大约占85%的比例。目前非小细胞肺癌主要的治疗方式包括手术、化疗、放疗。随着分子生物研究的深入发展促进了驱动突变的癌基因的发现,使生物治疗成为口服药物的后续发展。根据驱动癌基因突变的分子机制的不同将非小细胞肺癌分为不同的分子类型并针对不同分子类型产生了新的治疗方式,由此显著改变了肺癌的历史地位。在非小细胞肺癌里现发现的主要驱动突变基因包括EGFR、EML-4/ALK、KRAS、HER2、PIK3CA、BRAF、MET基因突变和ALK、 ROS1和RET基因重排,肿瘤的EGFR和ALK基因检测正逐步成为常规检测项目,而针对这些突变基因的靶向治疗药物已不断被研发出来,甚至大部分靶向药物已应用于临床,明显改善了非小细胞肺癌患者的预后。然而大部分患者在使用这些靶向治疗药物1年后可能就会出现耐药现象,因此新的驱动突变基因的发现有助于非小细胞肺癌的进一步治疗。VPS33B基因官方名称Vacuolar protein sorting 33 homologB(yeast),表达的蛋白叫做空泡蛋白分选蛋白(Vacuolar protein sorting-associated protein 33B),属于Secl/Munc-18(SM)蛋白家族成员之一,大鼠VPS33B基因的人类同源基因,编码区全长1854bp,编码617个氨基酸,分子量大小71kd。sec-1结构域蛋白的作用主要是参与蛋白的排序与液泡转运,将细胞内的小分子分类运输到相应的靶器官进而使其在体内发挥作用。目前有关VPS33B基因的报道主要集中在关节挛缩、肾功能不全和胆汁淤积综合征(ARC syndrome)和巨核细胞与血小板a-颗粒的生物合成等疾病上,尚未见其与肿瘤的发生发展有关系方面的报道。研究目的1.研究VPS33B在癌旁肺组织和肺癌组织以及肺癌细胞中的表达特性；2.研究VPS33B对肺癌细胞增殖能力的影响；3.研究VPS33B对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。研究内容和方法1.鉴定VPS33B在癌旁肺组织和肺癌组织以及肺癌细胞中的表达特性1)利用免疫组化和RT-PCR检测肺癌组织和癌旁肺组织中VPS33B的表达情况；2) 利用Western blot检测VPS33B在肺癌细胞株中的蛋白质表达水平,并筛选表达量低的两株肺癌细胞用于后续实验。2. VPS33B在体内外对肺癌细胞增殖能力的影响及分子机制1) 利用公司包装的慢病毒转染肺腺癌细胞株A549和H1975,建立稳定过表达VPS33B基因的肺癌细胞株；化学合成靶向VPS33B的siRNA干扰片段,瞬时干扰过表达VPS33B基因的肺癌细胞株；利用荧光定量PCR和Western blot进行VPS33B基因过表达的鉴定以及各干扰细胞中VPS33B基因干扰效率的鉴定,以其中干扰效率最高的一个做为下一步实验的研究对象；2)构建稳定过表达和瞬时干扰VPS33B的肺癌细胞株前后,MTT分别检测处理组和对照组中细胞活性的变化；3)稳定过表达和瞬时干扰VPS33B前后,平板克隆检测处理组和对照组中细胞增殖能力的变化；4)EDU实验检测稳定过表达和瞬时干扰VPS33B前后处于S期细胞比例在处理组和对照组间的差异；5)流式细胞仪检测稳定过表达和瞬时干扰VPS33B前后,细胞各周期分布在处理组和对照组间的差异；6) 裸鼠体内成瘤实验检测稳定过表达VPS33B前后,细胞活体内致瘤能力的变化,并将瘤子取出进行组织切片行免疫组化检测,观察相关蛋白表达量的变化；7) 利用Western blot检测稳定过表达VPS33B后,与细胞周期进展相关的重要蛋白的变化,探索VPS33B调控细胞周期相关的信号通路。3. VPS33B在体外对肺癌细胞迁移以及侵袭能力的影响及分子机制1) Transwell和Boyden实验检测稳定过表达和瞬时干扰VPS33B前后,处理组和对照组细胞间迁移和侵袭能力的改变；2) Western blot实验检测稳定过表达VPS33B后,细胞迁移和侵袭相关蛋白是否发生变化,从而探索VPS33B调控细胞迁移和侵袭的主要信号通路。4.统计学分析：采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。计量资料结果用x±s表示。荧光定量PCR结果中各细胞样本的2-△△Ct值的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若有统计学差异,多重比较间采用Dunnett法；EDU实验,平板克隆实验,细胞周期实验以及Transwell和Boyden等两组间实验结果比较采用两独立样本t检验；四格表x2检验用于两组间率的比较：P0.05认为差异具有统计学意义。结果1.VPS33B在肺癌及癌旁肺组织的表达情况以及临床意义在荧光定量PCR的实验结果中发现VPS33B mRNA在肺癌组织和癌旁肺组织的表达水平明显不同,具有显著性差异：免疫组化结果提示VPS33B的表达主要定位于细胞浆中,在肺癌组织和癌旁肺组织的表达水平也明显不同,差异具有显著性,以上两种实验检测结果具有一致性。统计分析发现VPS33B蛋白的表达水平与肺癌患者的临床分期相关性密切,即VPS33B表达越强,临床分期则越早；而VPS33B表达越弱或呈阴性表达,临床分期则越晚；Western blot实验表明VPS33B在肺癌细胞中的表达均偏低,其中A549和H1975两株细胞株表达量最低,因此选作后续实验。2. VPS33B在肺癌中抑制肺癌细胞在体内外的增殖及其分子机制1)慢病毒转染A549、H1975细胞株构建稳定过表达VPS33B的细胞株,荧光定量PCR以及Western blot实验结果表明成功建立了稳定过表达VPS33B的肺癌细胞株；2)MTT法检测过表达VPS33B基因后肺癌细胞体外的增殖情况,与A549-NC和H1975-NC细胞组相比,A549-VPS33B和H1975-VPS33B细胞的增殖速度明显减慢,并表现出时间依赖性关系；平板克隆形成实验显示A549-VPS33B和H1975-VPS33B细胞的体外增殖能力较对照组显著下降；EDU实验显示A549-VPS33B和H1975-VPS33B细胞中处于S期的比例较对照组减少,细胞的增殖能力减弱；流式细胞术检测的各组肺癌细胞周期的结果表明A549-VPS33B和H1975-VPS33B相对于对照组细胞的G1期比率有所增加,S期比率则明显减少,该实验结果提示过表达VPS33B后细胞增殖周期延缓；以上所有实验结果均表明过表达VPS33B后,肺癌细胞在体外的生长被显著抑制；3)将过表达VPS33B基因的实验组肺癌细胞和对照组肺癌细胞分别接种于裸鼠皮下,通过连续2-3周的观察,我们发现过表达VPS33B基因的肺癌细胞组相对于对照组显示出了显著抑制肺癌细胞体内增殖的能力。待瘤子长至一定大小在发生坏死前将其剥出测量提示,A549-VPS33B和H1975-VPS33B细胞皮下成瘤重量较对照组更轻且体积较对照组生长更小；4) Western blot实验检测过表达VPS33B基因后与细胞周期相关的重要基因的表达变化,实验结果表明C-myc, CDK6, CCND1, p-Rb and E2F1表达下调,P16表达上调。同时检测了,p-AKT,AKT,p-PI3K和P13K的表达,发现AKT, PI3K,PTEN表达不变,p-AKT and p-PI3K的表达下调。3. VPS33B在肺癌中抑制肺癌细胞在体外的迁移和侵袭能力及其分子机制1) Transwell和Boyden实验结果表明稳定过表达VPS33B后,肺癌细胞在体外的迁移和侵袭能力明显被抑制,表明VPS33B可以抑制肺癌细胞迁移和侵袭；2)稳定过表达VPS33B后,我们利用Western blot检测了与迁移和侵袭相关的重要调控因子的变化情况,发现Snail、N-cadherin和Vimentin表达下调,而E-cadherin表达上调。4.瞬时干扰VPS33B表达后对肺癌细胞生物学功能的改变利用阳离子脂质体将化学合成siRNA转染至肺癌细胞A549-VPS33B和H1975-VPS33B后利用荧光定量PCR和western blot检测其干扰效率,结果显示设计合成的3对siRNA序列中,三个干扰片段的干扰效率一致且干扰效率均在90%以上,以其中任意一个片段作为后续功能实验研究对象。MTT, EDU实验检测干扰VPS33B过表达前后细胞增殖的变化,结果表明干扰VPS33B过表达后肺癌细胞的增殖能力恢复；Transwell和Boyden实验结果表明瞬时干扰VPS33B过表达后,肺癌细胞在体外的迁移和侵袭能力恢复。以上实验再次从反面证明了VPS33B可以抑制肺癌细胞的增殖和转移、侵袭能力。结论：1.VPS33B与肺癌的发生发展密切相关；2.VPS33B可以抑制肺癌细胞的增殖；3.VPS33B可以抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。
【关键词】：肺癌 VPS33B 基因 增殖 迁移 侵袭 分子机制
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-23
• 参考文献19-23
• 第一章 肺癌细胞株及肺癌组织中VPS33B表达特性的鉴定23-39
• 一、材料与方法23-32
• 二、结果32-35
• 三、讨论35-36
• 参考文献36-39
• 第二章 VPS33B基因抑制肺癌细胞增殖及其分子机制39-57
• 一、材料和方法39-46
• 二、结果46-51
• 三、讨论51-55
• 参考文献55-57
• 第三章 VPS33B基因抑制肺癌细胞迁移和侵袭及分子机制57-68
• 一、材料和方法57-60
• 二、结果60-63
• 三、讨论63-65
• 参考文献65-68
• 全文小结68-70
• 致谢70-72

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本文编号：1127357