非小细胞肺癌中肝激酶B1的表达及功能研究

发布时间：2017-11-01 16:30

  本文关键词：非小细胞肺癌中肝激酶B1的表达及功能研究

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【摘要】：肺癌已是目前我国乃至全球范围内导致癌相关死亡人数最多的恶性肿瘤疾病,这些患者中超过85%为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC),其中最常见的两种亚型是腺癌(Adenocarcinoma, ADC)和鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma, SCC,其发病隐匿,大部分患者被诊断时已处于中晚期,手术作为最常用的,也是目前最有效的治疗手段,但对于中晚期患者的疗效及预后改善并不理想,且有些患者确诊时已无法接受手术治疗。而其他的传统治疗手段,如放射性疗法、化学疗法等均存在较大副作用,治疗效果也并不尽如人意,这就需要去寻找新的治疗手段。近年来针对肿瘤的基因治疗取得诸多突破,也面临一些问题,由于现阶段基因治疗的载体系统在人体内既不能特异性转染所有的肿瘤细胞,也不能使治疗基因在肿瘤内高效表达,所以治疗基因的生物学效应难以得到发挥,导致其抗肿瘤能力并未达到预期效果。并且肿瘤的发生是包含多种基因改变的多步骤过程,单独调节某一基因难以消灭肿瘤。因此,寻求能对肺癌起到高效抑制作用的抑癌基因和靶向性强、安全性好、表达效率高的载体就成为了基因治疗策略需要解决的问题。多项研究表明肝激酶Bl(Liver kinaseB1, LKB1)及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)与NSCLC的发生发展密切相关,其基因的缺失或下调会诱使NSCLC发生并极大促进其发病进程。本研究应用免疫组织化学法(IHC)检测了LKB1及PTEN两抑癌基因在NSCLC患者中的表达情况并结合临床信息分析其与NSCLC发生发展的潜在关系；应用免疫细胞化学法(ICC)、qPCR及western blot方法检测了A549,NCI-H23、 NCI-H157.XWLC-05四株NSCLC细胞系和一株SCLC细胞系NCI-H446中LKB1及PTEN的表达水平；通过AdMax系统构建重组腺病毒过表达载体Ad-LKB1,将目的基因导入肺癌细胞并实现LKB1在肺癌细胞中的过表达,并在体外细胞水平通过CCK-8增殖活性检测及细胞划痕修复实验初步探究LKB1对肺癌细胞,尤其是非小细胞肺癌细胞增殖及迁移能力的影响。我们发现在所检测的74例NSCLC患者中,有35例为PTEN阳性表达(47.3%),另有52例为LKB1阳性表达(70.3%)；该两基因的表达水平与患者性别、年龄、肺癌的病理组织亚型等无显著差异(P0.05),而与淋巴结转移、周围组织侵犯、临床分期等具有显著差异(P0.05)；联合LKB1及PTEN表达水平与患者发病恶性程度分析发现,LKB1与PTEN共同表达水平越高,其肿瘤恶性程度越低(P0.05)。在成功构建重组腺病毒载体Ad-LKB1后,我们发现在肺癌细胞内过表达LKB1基因,可以抑制肺癌细胞的增殖活性,且在表型为LKB1-/PTEN-的XWLC-05细胞中,抑制作用最为显著,而在表型为LKB1+PTEN+的NCI-H23细胞中,其增殖抑制作用相对较弱；在划痕修复实验中,相较于感染Ad-null的对照组细胞,感染Ad-LKB1的肺癌细胞的细胞迁移能力被显著抑制。本研究结果证实了LKB1及PTEN在NSCLC患者中存在一定的表达下调,且发现两者对于肺癌的恶性进展可能存在潜在的协同作用；通过体外细胞实验,初步证实了抑癌基因LKB1对肺癌细胞具有较强的抑制增殖及迁移作用。提示LKB1及PTEN可作为潜在的肺癌预后标志物；LKB1具有靶向治疗靶点的潜力,对应用于新型基因治疗方案提供了一定参考价值。对于LKB1抑制肺癌细胞活性具体分子机制及其与PTEN在肺癌中的协同作用还有待于进一步研究。
【关键词】：非小细胞肺癌 肝激酶B1 腺病毒载体 过表达 肺癌细胞系
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-16
• 缩略表16-19
• 第一章 绪论19-33
• 1.1 肺癌近年发展19
• 1.2 非小细胞肺癌病理亚型及分期19-23
• 1.3 非小细胞肺癌治疗现状23-25
• 1.4 mTOR信号通路25-28
• 1.5 LKB1肺癌的相关性28-32
• 1.6 研究目的及意义32-33
• 第二章 PTEN和LKB1在临床上非小细胞肺癌中的表达33-43
• 2.1 引言33
• 2.2 实验材料33-36
• 2.2.1 技术路线33
• 2.2.2 实验样本33-35
• 2.2.3 主要试剂35
• 2.2.4 主要设备35-36
• 2.3 实验方法36-37
• 2.3.1 免疫组织化学法检测PTEN和LKB1表达36
• 2.3.2 结果判定36-37
• 2.3.3 统计学分析37
• 2.4 结果37-41
• 2.4.1 非小细胞肺癌中PTEN和LKB1的表达37-39
• 2.4.2 PTEN和LKB1的表达与非小细胞肺癌恶性程度的关系39-41
• 2.5 讨论41-43
• 第三章 质粒转染LKB1的过表达43-67
• 3.1 引言43
• 3.2 实验材料43-50
• 3.2.1 技术路线43-44
• 3.2.2 实验样本44-48
• 3.2.3 主要试剂48-49
• 3.2.4 主要仪器49-50
• 3.3 实验方法50-59
• 3.3.1 细胞培养50-51
• 3.3.2 细胞中LKB1及PTEN本底表达水平检测51-54
• 3.3.3 质粒转染54
• 3.3.4 LKB1过表达检测54-59
• 3.4 结果59-64
• 3.4.1 细胞培养59-60
• 3.4.2 细胞本底表达水平检测ICC检测各细胞株LKB1及PTEN表达60-62
• 3.4.3 质粒转染及LKB1过表达检测62-64
• 3.5 讨论64-67
• 第四章 腺病毒载体构建67-85
• 4.1 引言67-68
• 4.2 实验材料68-73
• 4.2.1 技术路线68
• 4.2.2 实验样本68-71
• 4.2.3 主要试剂71-72
• 4.2.4 主要设备72-73
• 4.3 实验方法73-78
• 4.3.1 目的基因扩增73-74
• 4.3.2 构建携带目的基因的穿梭质粒74-75
• 4.3.3 重组腺病毒过表达载体包装75-76
• 4.3.4 收集病毒及扩增76
• 4.3.5 重组腺病毒TCID50测定76-78
• 4.4 结果78-82
• 4.4.1 LKB1基因扩增及重组质粒构建78-80
• 4.4.2 重组腺病毒过表达载体包装和收毒80-81
• 4.4.3 重组腺病毒滴度测定81-82
• 4.5 讨论82-85
• 第五章 体外细胞实验85-93
• 5.1 引言85
• 5.2 实验材料85-87
• 5.2.1 技术路线85
• 5.2.2 实验样本85-86
• 5.2.3 主要试剂86
• 5.2.4 主要设备86-87
• 5.3 实验方法87-89
• 5.3.1 腺病毒感染肺癌细胞87
• 5.3.2 CCK-8细胞活性检测87-88
• 5.3.3 检测迁移能力改变88-89
• 5.4 结果89-90
• 5.4.1 CCK-8细胞活性检测各细胞株感染ad-LKB1后的增殖影响89
• 5.4.2 细胞划痕实验检测细胞迁移能力改变89-90
• 5.5 讨论90-93
• 致谢93-95
• 参考文献95-101
• 附录A 攻读硕士期间发表论文101

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