结直肠癌干细胞源性exosomes分离鉴定及其免疫学性质的研究

发布时间：2017-11-01 20:23

  本文关键词：结直肠癌干细胞源性exosomes分离鉴定及其免疫学性质的研究

  更多相关文章： 结直肠癌 肿瘤干细胞 Exosomes 热休克 免疫治疗

【摘要】：结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,在西方国家中其发病率和致死率分别位于第三位和第二位。目前,对于结直肠癌的治疗还是以手术切除结合化学治疗或者放射线治疗为主。然而,该治疗方法虽然可以在一定程度上控制疾病的恶化,但是并不能彻底的治愈结直肠癌。因此,探索治疗结直肠癌的新方法成为该领域亟待解决的科学问题。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)具有和成体干细胞相似的自我更新和分化的能力。肿瘤干细胞假说认为,CSCs是肿瘤发生、转移和复发的基础。所以,以结直肠癌干细胞(Colorectal cancer stem cells,CR-CSCs)为靶点的研究为结直肠癌的治疗提供了新思路。Exosomes(EXO)是由细胞分泌的一种具有双层膜结构的小囊泡,其携带的蛋白质组分与母体细胞具有高度的相似性。肿瘤细胞来源的EXO会携带肿瘤表面抗原。近些年,关于肿瘤细胞来源的EXO作为肿瘤疫苗的相关研究以后较多报道。但是,关于CSCs来源EXO的免疫学相关研究相关报道较少。肿瘤细胞来源的EXO本身免疫原性较低,如何提高EXO的免疫原性成为该领域研究的难点。因此,提高CR-CSCs来源EXO的免疫原性对于结直肠癌的预防和治疗具有重要意义。本课题通过免疫磁珠法(Magnetic activated cell sorting,MACS)从培养的结直肠癌细胞系CT-26中分离CR-CSCs,通过形态观察、特异性标记检测及多能性基因的表达对CR-CSCs进行形态、表型和多能性的鉴定。利用沉淀剂从正常培养的CR-CSCs上清和热休克(Heat shock,HS)处理的上清中分离EXO,通过扫描电子显微镜观察和特异性标记检测,对分离的EXO进行形态和表型的鉴定。通过EXO与外周血单核淋巴细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)共培养实验,分析EXO对PBMCs的增殖能力、分泌能力和杀伤能力影响,并通过免疫印迹检测EXO中免疫相关分子的表达变化。最后,利用体内实验评价EXO的免疫预防作用和免疫治疗作用。体外实验结果表明:分离培养的CR-CSCs具有正常表型,并且能够成球形生长,此外,CR-CSCs能够表达多能性基因Sox2、Oct4和Nanog;热休克处理后的EXO(HS-EXO)仍然具有正常的形态和表面标记;在HS-EXO的刺激下,PBMCs的增殖能力和杀伤能力得到显著提高(P0.05),并且能够显著促进IFN-γ和IL-2的分泌(P0.05)及免疫相关分子HSP60、HSP90、HLA-1和ICAM-1的表达。体内实验结果表明:分离培养的CR-CSCs具有非常强的成瘤能力,接种13d后,PBS对照组所有小鼠全部长有肿瘤;经过HS-EXO和EXO免疫预防的小鼠肿瘤开始生长的时间明显延后,最后未长肿瘤小鼠数量显著低于PBS对照组(P0.001),而HS-EXO的预防效果在一定程度上优于EXO,但两者并没有显著差异;经过HS-EXO和EXO免疫治疗后,两组肿瘤生长的速度明显降低,未生长肿瘤小鼠的数量和小鼠的生存率显著高于对照组(P0.001),HS-EXO的治疗效果显著的优于EXO,两组未生长肿瘤小鼠数量存在显著差异(P0.05)综上所述,本课题以EXO为研究核心,以CR-CSCs为研究基础,探索热休克处理对CR-CSCs来源EXO的免疫学性质的影响。我们研究发现热休克处理没有影响EXO的基本性质,同时,可以提高EXO内HSP和免疫相关蛋白的表达,进而提高EXO的免疫原性,提高EXO的免疫预防功能和免疫治疗功能,为EXO疫苗的临床应用提供一定的科学数据。
【关键词】：结直肠癌 肿瘤干细胞 Exosomes 热休克 免疫治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 中英文对照9-13
• 第1章 绪论13-25
• 1.1 肿瘤干细胞的研究进展13-17
• 1.1.1 肿瘤干细胞起源13-14
• 1.1.2 肿瘤干细胞表面标记14-16
• 1.1.3 肿瘤干细胞免疫逃避16-17
• 1.2 结直肠癌干细胞的研究进展17-20
• 1.2.1 结直肠癌干细胞的起源17-19
• 1.2.2 结直肠癌干细胞的识别19-20
• 1.3 Exosomes的研究进展20-22
• 1.3.1 Exosomes的组成21
• 1.3.2 肿瘤细胞来源exosomes的免疫调节功能21-22
• 1.4 热休克蛋白22-23
• 1.5 立题依据23-25
• 第2章 材料和方法25-36
• 2.1 实验动物25
• 2.2 实验材料25-28
• 2.2.1 实验仪器25-26
• 2.2.2 实验试剂26-27
• 2.2.3 引物27
• 2.2.4 细胞系27-28
• 2.3 实验方法28-36
• 2.3.1 购买CT-26的处理28
• 2.3.2 CT-26的冻存保种28
• 2.3.3 CT-26肿瘤干细胞的分离培养28-29
• 2.3.4 RNA的分离和提取29-30
• 2.3.5 RNA的反转录30-31
• 2.3.6 PCR31
• 2.3.7 免疫印迹31-32
• 2.3.8 免疫组织化学32
• 2.3.9 肿瘤干细胞的热休克处理32
• 2.3.10 Exosomes的分离32-33
• 2.3.11 Exosomes形态学鉴定33
• 2.3.12 Exosomes特异性标记的鉴定33
• 2.3.13 PBMCs的分离33-34
• 2.3.14 PBMCs的增殖实验34
• 2.3.15 Exosomes对PBMCs因子分泌的影响34
• 2.3.16 PBMCs对肿瘤干细胞的杀伤作用34-35
• 2.3.17 Exosomes的免疫保护实验35
• 2.3.18 Exosomes的免疫治疗实验35-36
• 第3章 实验结果36-48
• 3.1 肿瘤干细胞的分离培养和鉴定36-39
• 3.1.1 CT-26细胞的培养36
• 3.1.2 CT-26肿瘤干细胞的分离、培养和鉴定36-39
• 3.2 结直肠癌干细胞源性Exosomos的分离和鉴定39-40
• 3.3 Exosomes在体外对PBMCs增殖和因子分泌的影响40-43
• 3.4 Exosomes作为疫苗的抗肿瘤效应43-48
• 第4章 结论48-49
• 第5章 讨论49-53
• 参考文献53-59
• 致谢59

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