MTDH基因转染对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和紫杉醇敏感性影响的研究

发布时间：2017-11-03 08:11

  本文关键词：MTDH基因转染对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和紫杉醇敏感性影响的研究

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【摘要】：目的:乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一,且乳腺癌发病呈持续上升趋势。乳腺癌的复发、转移和多药耐药仍是临床亟待改善和解决的难题。MTDH原癌基因增强肿瘤细胞的增殖及抗凋亡能力,促进肿瘤新血管生成,并与肿瘤细胞侵袭、扩散、转移及化疗耐药相关。本实验研究MTDH高表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及对紫杉醇耐药性的影响。方法:1慢病毒介导MTDH高表达的MCF-7稳转细胞株的构建和鉴定:MTDH基因表达质粒,经大肠杆菌转化扩增,提取纯化后送测序鉴定。测序成功后使用慢病毒感染MCF-7细胞,通过绿色荧光蛋白GFP检测转染效率。使用嘌呤霉素进行加压筛选,获得稳定高表达MTDH基因的新的乳腺癌细胞株(命名为MCF-7-MTDH)和阴性对照病毒稳定转染的乳腺癌细胞株(命名为MCF-7-vector)。采用RT-PCR方法分别检测空白对照组(MCF-7细胞)、阴性对照组(MCF-7-vector细胞)、实验组(MCF-7-MTDH细胞)的MTDH m RNA表达水平验证转染效果。2 CCK法检测细胞增殖及对紫杉醇的敏感性:以MCF-7作为空白对照,以MCF-7-vector作为阴性对照,检测MTDH高表达对MCF-7细胞增殖和对紫杉醇药物敏感性的影响。3流式细胞术检测细胞周期及紫杉醇对细胞周期的影响:以MCF-7作为空白对照,以MCF-7-vector作为阴性对照,检测MTDH高表达对细胞周期的影响,并检测紫杉醇药物对细胞周期的影响。4统计分析:每组实验至少有3个独立样本的重复,应用SPSS17.0统计软件对实验数据进行统计分析。数据用均数±标准差(x±s)表示,进行t检验(t-test)、单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)或非参数检验(Nonparametric test),检验以P0.05为差异有显著性意义。结果:1慢病毒介导高表达MTDH乳腺癌稳转细胞株的构建和鉴定MCF-7细胞MOI值检测:显微镜下观察慢病毒感染后细胞绿色荧光蛋白GFP表达情况,实验结果显示乳腺癌MCF-7细胞的MOI(Multiplicity Of Infection,MOI)值为20,即细胞感染效率达到80%,且细胞形态在感染前后无明显改变。高表达MTDH的MCF-7稳转细胞株的构建与鉴定:慢病毒感染MCF-7细胞72h后,通过荧光显微镜观察MCF-7-MTDH实验组和MCF-7-vector对照组均可见绿色荧光蛋白表达,转染效率都超过80%。经嘌呤霉素加压筛选获得稳定转染的MCF-7-MTDH细胞株和MCF-7-vector细胞株。通过RT-PCR检测MCF-7细胞、MCF-7-vector细胞、MCF-7-MTDH细胞中MTDH基因m RNA表达水平分别为1.000±0.100、1.013±0.169、2.093±0.055。统计分析结果显示MCF-7细胞与MCF-7-vector细胞MTDH基因m RNA表达未见明显差异(P0.05),MCF-7-MTDH细胞MTDH基因m RNA表达高于MCF-7细胞、MCF-7-vector细胞,差异有统计学意义(P0.05)。2 MTDH高表达对细胞增殖和细胞周期的影响将MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三种细胞分别作为空白对照组、阴性对照组和实验组。CCK法检测各组细胞于0h、24h、48h、72h的增殖情况,统计分析显示空白与阴性对照两组细胞增殖未见明显差异(P0.05),实验组MCF-7-MTDH细胞增殖快于对照两组,差异有统计学意义(P0.01)。流式细胞仪检测各组的细胞周期,结果显示空白对照组、阴性对照组、实验组细胞G0/G1期的比例分别为32.90±1.48%、34.70±1.65%、28.80±1.21%;S期比例分别为43.40±0.95%、40.37±3.61%、57.60±2.10%;G2/M期的比例分别为23.67±0.80%、23.60±2.51%、13.57±2.11%。统计分析结果显示空白及阴性对照组的细胞周期无显著差异(P0.05),而与对照对相比实验组细胞S期延长,G0/G1期和G2/M期缩短(P0.05)。3紫杉醇对转染前后乳腺癌细胞增殖和周期的影响将MCF-7、MCF-7-vector、MCF-7-MTDH三种细胞分别作为空白对照组、阴性对照组和实验组。CCK法检测1ug/ml紫杉醇作用24h对三组细胞的抑制率分别为63.71±0.31%、64.15±0.17%、45.72±0.41%;1ug/ml紫杉醇作用48h对三组细胞的抑制率分别为37.46±0.17%、37.10±0.14%、25.90±0.31%;10 ug/ml紫杉醇作用24h对三组细胞的抑制率分别为71.11±0.87%、72.55±0.68%、66.97±0.84%;10 ug/ml紫杉醇作用48h对三组细胞的抑制率分别为69.95±0.43%、70.77±0.21%、59.95±0.53%,统计分析结果显示在药物浓度、作用时间都相同条件下空白及阴性对照组的紫杉醇抑制率未见明显差异(P0.05)。1ug/ml、10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后对实验组MCF-7-MTDH细胞的抑制率均低于两对照组,差异有统计学意义(P0.05)。空白对照组细胞10ug/ml紫杉醇作用24h和48h后抑制率未见明显差异(P0.05),其余各组紫杉醇作用48h后抑制率较24h降低,差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞仪检测紫杉醇用药后各组的细胞周期,统计分析结果显示:紫杉醇药物诱导各组细胞G2/M期比例增高,10ug/ml用药组较1ug/ml用药组增高更加明显(P0.05);药物浓度相同的情况下,MCF-7、MCF-7-vector细胞的G2/M期比例无显著差异(P0.05),而MCF-7-MTDH细胞的G2/M期比例低于MCF-7、MCF-7-vector细胞,有显著性差异(P0.05)。结论:1通过慢病毒介导成功的构建MTDH高表达稳定转染MCF-7细胞株。2 MTDH高表达可促进乳腺癌MCF-7细胞增殖。3 MTDH高表达可促使乳腺癌MCF-7细胞G2/M期比例下调,降低细胞对紫杉醇的敏感性。
【关键词】：乳腺癌 MTDH 细胞增殖 紫杉醇 药物敏感性
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-24
• 结果24-26
• 附图26-31
• 附表31-34
• 讨论34-37
• 结论37-38
• 参考文献38-41
• 综述 肿瘤耐药及MTDH介导耐药机制的相关研究41-54
• 参考文献49-54
• 致谢54-55
• 个人简历55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 张珂;张霞;孙彩萍;胡滨;;多药耐药相关蛋白2基因在COC1/DDP细胞对顺铂耐药中的作用[J];肿瘤基础与临床;2015年05期

2 陈万青;郑荣寿;;中国女性乳腺癌发病死亡和生存状况[J];中国肿瘤临床;2015年13期

3 张华耀;刘建平;苏正;杨尚霖;韦金星;汪洋;;多药耐药相关蛋白4在肝癌细胞株SMMC-7721中化疗耐药的作用[J];中华实验外科杂志;2015年03期

4 肖颖;赵玉斌;;红豆杉中紫杉醇抗癌研究进展[J];现代中西医结合杂志;2008年35期

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本文编号：1135337