EAAL细胞联合全反式维甲酸对人肺腺癌细胞株A549体内外作用的研究

发布时间：2017-11-04 20:05

  本文关键词：EAAL细胞联合全反式维甲酸对人肺腺癌细胞株A549体内外作用的研究

  更多相关文章： EAAL ATRA 肺腺癌 细胞凋亡 裸鼠移植瘤

【摘要】：目的:观察体外扩增活化的自体淋巴细胞(Expanded ActivatedAutologouse Lymphocytes,EAAL)与全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)联合应用对肺癌细胞株A549及裸鼠肺癌移植瘤的杀伤作用,探讨两者联合应用的相关机制,为开展有效的肺癌生物治疗提供实验和理论依据。方法:1 EAAL细胞与全反式维甲酸对A549细胞体外作用研究:实验主要分为4组,依次为Control组,EAAL组,ATRA组,EAAL+ATRA组。(1)光学显微镜下观察各组A549细胞形态学的变化。(2)SRB比色法检测各组A549细胞生长增殖变化。(3)细胞划痕实验检测各组A549细胞迁移能力。(4)流式细胞术检测各组A549细胞周期分布情况。(5)RT-PCR技术检测A549细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Survivinm RNA的表达情况。(6)免疫组化技术及western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Survivin的表达情况。2 EAAL细胞与全反式维甲酸对A549细胞裸鼠皮下移植瘤体内作用研究裸鼠成瘤后随机分为6组,依次为:空白对照组(生理盐水组)、阳性对照组(0.5mg/kg,DDP)、ATRA组(15mg/kg)、EAAL细胞组(1×107个/次)、EAAL细胞与ATRA同时联合应用组、EAAL细胞与ATRA序贯联合应用组。(1)处理过程中,隔日测量裸鼠肿瘤体积,建立各组肿瘤生长曲线;处理结束后,处死全部裸鼠,完整剥除瘤体,测量肿瘤块儿体积,计算肿瘤抑制率,比较各组对肿瘤生长的影响,HE染色观察肿瘤细胞形态学变化。(2)免疫组化技术检测各组荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Survivin的表达情况。结果:1将EAAL细胞和/或ATRA作用于A549细胞48h后,随着ATRA的浓度和EAAL细胞效靶比的升高,A549细胞开始出现皱缩、变圆、脱落、体积变小及数量减少等形态学方面的改变,并且可见凋亡小体。而对照组A549细胞大小均匀、生长密集。与对照组相比,EAAL细胞或ATRA单独处理组对A549细胞的形态学方面的杀伤效果显著,EAAL+ATRA组对A549细胞形态学杀伤作用较以上各单独处理组均有明显增强。2 SRB实验结果显示,ATRA和EAAL细胞对A549细胞增殖有显著的抑制作用(P0.05),并且存在浓度(效靶比)和时间依赖性,ATRA的最适浓度为10-5mol/L,EAAL细胞的最适效靶比为50:1,并且EAAL联合ATRA处理对A549细胞杀伤活性与对照组和单独使用ATRA或EAAL细胞相比,其杀伤活性均明显增加(P0.05)。3经ATRA(10-5mol/L)或EAAL细胞(50:1)单独或二者联合处理后,与对照组相比,A549细胞的迁移速度均有所减慢(P0.05),其中联合处理组的迁移速度的减慢更为显著,差异具有统计学意义(P0.01)。4流式细胞术分析结果显示,经ATRA(10-5mol/L)或EAAL细胞(50:1)单独或二者联合处理后,与对照组相比,A549细胞周期均有延迟,其中G1期比例明显升高,S、G2/M期比例下降,联合处理组相对单独处理,A549细胞周期延迟更为显著(P0.05),差异具有统计学意义。5 RT-PCR实验结果显示,与对照组相比,ATRA(10-5mol/L)和EAAL细胞(50:1)单独或二者联合处理后,A549细胞Bcl-2和survivin的m RNA表达水平均降低(P0.05),联合处理组相对单独处理,表达水平降低更为显著(P0.05);Bax m RNA表达水平均增高,联合处理组相对单独处理,Bax m RNA表达水平升高更为显著(P0.05)。6免疫组化和Western blot实验结果显示,经ATRA(10-5mol/L)和EAAL细胞(50:1)单独或二者联合处理后,A549细胞Bcl-2和survivin蛋白表达水平与对照组相比均降低(P0.05),联合处理组相对单独处理,表达水平降低更为显著(P0.05),Bax表达水平均增高(P0.05),联合处理组相对单独处理,A549细胞Bax表达水平升高更为显著(P0.05)。7将A549细胞移植于36只裸鼠右前上肢腋下中外侧皮下后均成瘤,成瘤率为100%。用药期间各组(空白对照组、DDP组、ATRA组、EAAL细胞组、EAAL细胞与ATRA同时组、EAAL细胞与ATRA序贯组)荷瘤裸鼠饮食及精神状态未见明显异常;用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义(P0.05),处理结束后测量各组裸鼠体重,差异无统计学意义(P0.05)。处理期间(空白对照组、DDP组、ATRA组、EAAL细胞组、EAAL细胞与ATRA同时组、EAAL细胞与ATRA序贯组)荷瘤裸鼠肿瘤体积仍在增大,各用药组肿瘤抑制率分别为74.2%、30.8%、44.2%、73.2%、73.6%,除ATRA组和EAAL组(P0.05)、ATRA与EAAL细胞同时组和序贯组(P0.05)无显著差异外,差异均有统计学意义(P0.05),且两联合处理组的肿瘤抑制率显著高于两单独处理组(P0.05)。8免疫组化分析结果:实验各组Bcl-2的免疫反应积分显示,与空白对照组相比,EAAL或ATRA单独处理组荷瘤裸鼠肿瘤组织Bcl-2蛋白表达水平均明显下降(P0.05),两单独处理组之间无显著性差异(P0.05),二者联合处理组(同时组+序贯组)与空白对照组和两单独处理组相比均显著降低(P0.05),两者同时作用组和序贯作用组之间无显著性差异(P0.05);两联合处理组较两单独处理组荷瘤裸鼠肿瘤组织,对Bax蛋白表达增高水平更为显著(P0.05);EAAL和ATRA单独或联合处理均能降低荷瘤裸鼠肿瘤组织survivin表达水平(P0.05),且两联合处理组较两单独处理组显著下调Survivin蛋白水平的表达(P0.05)。9 ELISA结果:实验各组裸鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平检测结果显示,联合处理组(同时组和序贯组)与空白对照组和两单独处理组相比,IL-2和IFN-γ的分泌水平均显著升高(P0.01)。结论:1 EAAL细胞与ATRA联合作用对肺腺癌细胞A549增殖抑制、细胞周期阻滞和促凋亡具有显著的协同作用。2 EAAL细胞和ATRA联合应用可下调Bcl-2和survivin并上调Bax的表达水平,提示联合作用可能通过影响凋亡相关基因的表达而发挥作用;并增强IL-2、IFN-γ的分泌,增强对A549细胞的杀伤能力,从而抑制肿瘤细胞在体内外的生长。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 刘敏;王群兴;杨东亮;;肝细胞表达的免疫相关分子与肝脏疾病[J];免疫学杂志;2013年01期

2 冯钟煦;刘剑勇;;树突状细胞的研究进展[J];医学综述;2012年20期

3 金莎;田建辉;;肺癌的免疫治疗临床研究进展[J];中国肺癌杂志;2012年10期

4 ;CIK cells from patients with HCC possess strong cytotoxicity to multidrug-resistant cell line Bel-7402/R[J];World Journal of Gastroenterology;2005年22期

5 吴乔 ,陈玉强,陈正明,陈福,苏文金;视黄酸在体内外对胃癌细胞转移及其相关蛋白的影响(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2002年09期

，

本文编号：1140897