DEPDC7基因在肝癌细胞中的功能学及其启动子的实验研究

发布时间：2017-11-05 09:29

  本文关键词：DEPDC7基因在肝癌细胞中的功能学及其启动子的实验研究

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【摘要】：目的功能未知基因DEPDC7是从基因芯片数据挖掘得到,DEPDC7基因在肝癌细胞内参与的生命活动及其分子机制鲜有报道。本研究通过探讨DEPDC7基因对肝癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭迁移能力的影响,并初步鉴定了DEPDC7基因的核心启动子区域,为研究该基因的转录调控机制等指明方向。方法(1)提取肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-Hep-1和SMMC-7721以及正常肝细胞L-02的DEPDC7 RNA和蛋白,通过Real-Time PCR和Western blot方法检测DEPDC7基因在m RNA和蛋白水平上的表达差异。(2)构建过表达重组载体pLV-DEPDC7和沉默重组载体p LV-DEPDC7-sh RNA,通过慢病毒包装并感染细胞的方法,获得DEPDC7过表达细胞株和沉默细胞株,并通过Real-Time PCR和Western blot方法检测DEPDC7的表达情况。(3)利用MTT法和平板克隆法检测各实验组细胞的增殖能力和克隆形成能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell小室检测细胞的侵袭迁移能力。(4)利用生物信息学方法对人DEPDC7基因的启动子区域进行分析和预测,通过PCR法扩增DEPDC7基因近端启动子序列,构建一系列的启动子区域荧光素酶报告基因载体,随后经脂质体转染入细胞内并检测各缺失片段萤光素酶活性。结果(1)与正常肝细胞L-02比较,DEPDC7的m RNA和蛋白水平在四株肝癌细胞中均是低表达。(2)成功建立DEPDC7基因过表达肝癌细胞系Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7,蛋白表达显著提高。成功建立DEPDC7基因沉默肝癌细胞系Hep G2-RNAi,m RNA和蛋白水平均显著降低。(3)与对照组细胞相比,DEPDC7基因表达上调可以将Huh7-DEPDC7和SK-Hep-1-DEPDC7的细胞周期阻滞在G0/G1期。相应的,细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭迁移能力明显下降。(4)与对照组细胞相比,DEPDC7基因表达下调可以将Hep G2-RNAi的细胞周期促使从G0/G1期向S期转变。相应的,细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭迁移能力明显增加。(5)人DEPDC7基因位于11p13。成功构建不同长度缺失片段的启动子重组质粒。经双荧光素酶报告基因检测后发现,与对照组相比,所有的重组质粒均表现出荧光素酶活性,其中DEPDC7P-3活性最强。结论(1)本研究首次探讨了DEPDC7基因在肝癌细胞发生发展过程中所起的作用。DEPDC7基因过表达可以明显抑制肝癌细胞生长增殖,干扰DEPDC7基因则可以明显提高肝癌细胞增殖能力。推测DEPDC7基因参与细胞周期调控,通过调节细胞周期从G0/G1期向S期转变进而调节细胞增殖能力的改变。(2)DEPDC7基因过表达可以明显抑制肝癌细胞侵袭迁移,相反干扰DEPDC7基因则可以明显促进肝癌细胞侵袭迁移。推测DEPDC7基因影响MMPs的表达,通过破坏MMPs和TIMPs动态平衡最终调节细胞侵袭迁移能力的改变。(3)本研究首次探讨了DEPDC7基因的启动子,并得出DEPDC7基因的核心启动子区域可能位于-879 bp~+100 bp区域。综上所述,本研究鉴定了一个新的肝癌相关基因DEPDC7,同时我们推测该基因在肝癌治疗中可以作为一个潜在的标记基因。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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本文编号：1143637