受体介导的HCV入侵小鼠肝癌细胞研究

发布时间：2017-11-08 03:23

  本文关键词：受体介导的HCV入侵小鼠肝癌细胞研究

  更多相关文章： 丙型肝炎病毒 慢病毒转染 细胞模型 LDLR SR-BI CD81

【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种经血液传播的RNA病毒,呈全球性流行。全世界有近1.7亿人感染,每年的新发病例约有350万例,感染率约3%。HCV感染机体后会引起急性肝炎,其中约75%以上会转化为慢性肝炎,并逐步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。由于治疗方法有限且缺乏合适的疫苗,使得丙型肝炎防治一直是世界性难题,也引起了众多研究学者的关注。HCV具有严格的种属特异性,只能感染人类和黑猩猩。在实验研究中,由于价格昂贵及伦理等问题难以获得黑猩猩,导致目前还缺乏有效的可用于HCV感染性研究的细胞及动物模型,这也极大阻碍了HCV感染性研究的进程。HCV感染靶细胞是一个由多分子共同作用的复杂过程。大部分研究者认为,介导HCV进入靶细胞的主要受体分子包括低密度脂蛋白受体(Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR)、CD81、B族I型清道夫受体(Scavenger Receptor Class B Type I,SR-BI)、紧密连接区域Claudin-1(CLDN-1)和occludin(OCLN),且CD81和OCLN是HCV进入靶细胞必不可少的两个分子。HCV与低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein,LDL)或者极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)结合形成复合物(lipoviral particles,LVPs),肝细胞膜表面的葡聚糖氨基聚糖类(glycosaminoglycans,GAGs)和低密度脂蛋白受体LDLR可以使LVPs结合到靶细胞表面,通过膜表面其它的HCV受体分子共同作用,最终经网格蛋白(clathrin)介导的胞吞作用及低p H引发病毒包膜与内体膜的融合,使得HCV衣壳释放,进入胞浆。尽管CD81和OCLN两个分子就可引起病毒进入,但其它受体分子在HCV进入肝细胞时的权重或联合作用能否进一步促进病毒进入还不甚清楚;介导HCV入胞的相关受体分子是如何参与病毒早期感染的也需要进一步探讨。本课题的目的是构建能够体外感染HCV的转基因小鼠肝癌细胞模型,并在细胞模型的基础上进一步研究介导HCV入胞的受体分子在病毒对靶细胞内源化过程中的作用。研究结果如下:一、转基因小鼠肝癌细胞株的筛选。通过慢病毒转染的方法,筛选能够稳定表达HCV多种受体分子的转基因小鼠肝癌细胞株。利用脂质体介导的方法,将串联表达介导HCV感染相关受体分子的重组慢病毒载体和包装质粒共转入包装细胞,包装相应慢病毒;将包装的慢病毒攻击小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,荧光活细胞法或加压筛选得到过表达HCV多种膜受体分子的转基因小鼠肝癌细胞株。RT-PCR、激光共聚焦显微镜和免疫印迹均检测到相应受体分子的表达。二、构建的转基因小鼠肝癌细胞株可使HCVpp内源化。利用脂质体介导方法,将构建的表达HCV包膜蛋白和萤火虫荧光素酶的两个重组载体和包装质粒共转入包装细胞,包装病毒HCVpp;用HCVpp病毒孵育转基因细胞,可检测到内源化的HCVpp。三、转基因细胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6能使HCV病毒自然感染,且介导HCV入胞的受体分子按照LDLR-SR-BI-CD81和CLDN-1-OCLN的排列顺序更易促进病毒入侵靶细胞。通过HCV阳性血清直接感染实验,证实筛选的转基因细胞株可被HCV病毒自然感染,且LDLR能促进血清病毒进入;利用慢病毒转染的方法筛选出LDLR-CD81-SR-BI和CLDN-1-OCLN串联顺序表达的转基因小鼠肝癌细胞株LCSCO/Hepa1-6;通过比较转基因细胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6对血清中HCV病毒的易感性,发现HCV更易进入LSCCO/Hepa1-6细胞内,这可能与该细胞膜表面的HCV受体分子排列顺序有关,即HCV受体分子的排列顺序对病毒入侵有影响。四、由于HCV存在形式的不同,导致HCVcc感染与病毒自然感染不同,LDLR在HCVcc病毒内源化中所起作用不显著。通过比较两种转基因细胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6对HCVcc的结合及进入,未发现LDLR的存在对HCVcc进入有明显的影响;为排除分子串联对其可能存在的影响,使之更接近体内状态,故将串联的重组慢病毒载体进行改构并构建单分子表达的慢病毒载体;经脂质体转染细胞系Hepa1-6后孵育HCVcc,检测细胞内HCV RNA拷贝数,发现,各受体分子单独表达与串联表达时,病毒内源化基本一致;考虑到病毒自然感染与HCVcc感染时病毒存在形式不同,以及不同病毒入胞与其结合的受体分子也不同,故将LDLR和SR-BI对HCVcc进入靶细胞过程的作用做了比较;发现,SR-BI是HCVcc感染的必需分子。研究结果表明,HCVcc感染和自然感染不同,靶细胞膜表面介导HCV入胞的受体分子LDLR对HCVcc感染影响不明显。综上所述,本研究构建了稳定表达不同数量和不同串联顺序的HCV相关受体分子的转基因小鼠肝癌细胞株SCCO/Hepa1-6、LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6;证实了这些转基因细胞株可引起病毒内源化,并有望作为细胞模型用于体外HCV感染的相关研究;通过比较细胞株LSCCO/Hepa1-6和LCSCO/Hepa1-6对HCV阳性血清的易感性,证实了HCV在进入靶细胞时要优先与SR-BI作用;通过比较细胞株SCCO/Hepa1-6和LSCCO/Hepa1-6对HCVcc的易感性,证实SR-BI是介导HCVcc早期入胞的关键分子,且HCVcc感染与病毒自然感染的早期入胞过程不同,LDLR在HCVcc早期入胞中作用不明显。本文通过对HCV相关受体分子在HCV病毒感染细胞中的作用研究,证实了HCV在进入靶细胞时优先与SR-BI作用,这为今后抗HCV感染药物靶点的研究提供了新思路。本研究中构建的细胞模型也为抗HCV感染药物的筛选、评价及疫苗的研制等奠定了一定的基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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本文编号：1155393