人脐带间充质干细胞微囊对膀胱肿瘤侵袭转移能力调控机制研究

发布时间：2017-11-08 23:07

  本文关键词：人脐带间充质干细胞微囊对膀胱肿瘤侵袭转移能力调控机制研究

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【摘要】：目的:通过应用人脐带间充质干细胞微囊干预膀胱肿瘤细胞(T24细胞),探讨人脐带间充质干细胞微囊对膀胱肿瘤细胞侵袭转移过程中的作用,并探讨其中可能影响到的信号通路。方法:(1)征得参与者书面同意后,获取人新鲜脐带,无菌条件下提取剖宫产出生的健康足月新生儿的脐带和胎盘,人脐带间充质干细胞采用贴壁法进行原代培养,应用DMEM培养液(含10%胎牛血清)中培养,待细胞融合到80-90%时,1:3传代。采用流式细胞仪检测两种细胞的表面标志,通过检测抗人CD14,CD31,CD34,CD44,CD45,CD73,CD90,CD105等对细胞进行鉴定,光镜下观察细胞形态,取第3-6代用于实验。(2)分离、鉴定h WJMSCs-MVs及蛋白定量分析,取第3-6代h WJMSCs,采用无血清低糖DMEM+0.25%BSA(牛血清蛋白)进行培养48h后,收集上清培养基。2000g离心30min去除细胞碎片。100,000g超速离心1h,弃上清,M199重悬,100,000g离心1h,弃上清,M199 200μl重悬备用。采用乳胶珠吸附MVs后流式细胞技术鉴定其膜表面分子(CD9,CD34,CD44,CD45,CD63,CD73)。采用Bradford法进行h WJMSC-MVs蛋白定量。采用透射电镜负染法鉴定h WJMSC-MVs。(3)探索h WJMSC-MVs对膀胱肿瘤细胞侵袭转移的调控情况及信号通路分析:培养T24细胞12h后,分别加入100,μg/ml protein h WJMSC-MVs,继续培养48h。应用细胞划痕实验及Transwell小室法检测肿瘤细胞侵袭转移能力。Western Blot检测E-cadherin,N-cadherin,Snail,MMP2,MMP9,β-catenin,ZEB1,Vimentin表达水平;(4)应用SPSS软件进行数据分析。结果(1)采用组织块贴壁法成功从人脐带中分离出h WJMSCs,经过1-3次传代后h WJMSCs呈贴壁生长,长梭形,形态均一,增殖旺盛。流式细胞技术鉴定显示h WJMSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105,而不表达CD14,CD31,CD34,CD45,这些特征符合国际细胞治疗协会关于MSCs的定义。(2)采用高速离心的方法成功地从h WJMSCs上清液中分离出MVs,并行透射电镜及流式细胞技术检测。MVs表面表达CD9,CD44,CD63,CD73,而不表达血源性干细胞分子CD34,CD45。(3)微囊处理结果:h WJMSC-MVs处理膀胱肿瘤T24细胞后,划痕实验及Transwell小室实验表明实验组膀胱肿瘤细胞侵袭转移能力明显降低,蛋白定量检测结果表明,上皮间质转化相关分子E-cadherin表达升高,N-cadherin、Vimitin、Snail表达明显降低(P0.05)。结论(1)人脐带间充质干细胞微囊能够抑制膀胱肿瘤细胞的侵袭转移能力;(2)人脐带间充质干细胞微囊能够抑制膀胱肿瘤细胞上皮转化作用,从而影响T24细胞的侵袭及转移(3)人脐带间充质干细胞微囊能够抑制AKT/Snail通路,进而抑制侵袭及转移。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14

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本文编号：1159220