非小细胞肺癌患者血液循环DNA含量及完整性的研究
本文关键词：非小细胞肺癌患者血液循环DNA含量及完整性的研究
更多相关文章： 非小细胞肺癌 NSCLC 血液循环DNA cfDNA含量 完整性指数 EGFR 基因突变
【摘要】：(一)免提取cfDNA含量及完整性检测方法建立及性能评价背景非小细胞肺癌是肺癌中最常见的类型,包括腺癌,鳞癌,细支气管肺泡癌和大细胞癌。大约70%的患者在确诊时,已是晚期或远处转移,不能得到很好的治疗,所以尽早发现非常重要。肿瘤患者血液中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)包括循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),主要来源于细胞的凋亡和坏死。血液循环中的癌细胞和远处转移的癌细胞同样释放cfDNA,可以通过检测cfDNA含量来估算肿瘤负荷、评价治疗效果。DNA的完整性(Integrity)有别于非肿瘤人群是肿瘤患者cfDNA的另一个显著特征。目前定量常用PCR方法,第一步需要提取血液循环DNA,这是一个极容易产生误差的步骤。即便不考虑操作者的因素,提取方法和试剂的不同就会造成巨大误差。目的研究一种方法,不经过DNA提取步骤,直接对血液中的循环DNA进行定量,可以去除DNA提取试剂盒和操作人员差异造成的DNA提取误差。方法通过提取和免提取cfDNA直接定量的两种方法来对比检测cfDNA,比较两者的扩增效率,精密度及准确度。结果我们通过特殊的技术工艺处理,可以直接用血清进行定量PCR,不影响PCR反应,扩增效率与提纯DNA一致,可精确检测出低至ng水平的血清游离DNA,检测范围1-10000ng/ml,本方法具有较高的准确度及精密度。相比先用试剂盒提取cfDNA,在定量结果的稳定性、重复性等方面都有显著改善。(二)非小细胞肺癌患者cfdna含量及完整性的研究背景近年来,血液循环dna(cfdna)作为一种潜在的肿瘤标志物已经受到越来越多人的关注,因为它的检测创伤很小而且方便,所以比较容易被人们接受。cfdna的水平在健康人和良性疾病病人中较低,但是在非小细胞肺癌患者的血液中有非常明显的增加。癌症病人的循环肿瘤dna的完整性也是其重要特征之一。因此联合cfdna的含量和完整性可能是诊断癌症的一个很好的指标。目的通过比较非小细胞肺癌患者和健康人的循环dna的含量及完整性,来评价循环dna含量及完整性用于诊断nsclc的临床价值。方法采用本实验室创立的免提取血液循环dna含量及完整性检测的pcr技术,对非小细胞肺癌患者及健康人的循环dna进行定量,分析比较两组的区别。结果1.nsclc病人组及健康对照组的cfdna含量中位数(四分位距)分别为212(622.25)ng/ml和65.4(290.65)ng/ml,二者差异具有统计学意义,p0.05;而完整性指数(dii)的中位数(四分位距)分别是0.0764(0.276)和0.066(0.186),两组之间的差异无显著性,p0.05。2.cfdna含量和完整性指数(dii)在不同性别、年龄及肿瘤病理类型间的差异无统计学意义,p值均大于0.05;而在不同病理分期的组间差异都具有统计学意义,p0.05。3.循环dna含量用来区分nsclc患者和健康人群的auc是0.659,此时的敏感性为72.3%,特异性为59.5%,cut-off值为87.5ng/ml。(三)非小细胞肺癌组织egfr信号途径相关基因突变的检测背景目前,与nsclc靶向治疗相关几个信号途径已经被研究多年,其中最主要的是表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)信号途径,针对该途径研制开发的酪氨酸酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,tki),常用的药物有厄洛替尼,吉非替尼,西妥昔单抗等,都在临床上取得了不错的疗效。egfr信号通路中,egfr、kras、pik3等基因是否存在缺失、重排或点突变,都可以显著影响上述靶向药物疗效。所以,临床上在应用靶向药物之前,常规都会进行相关靶点基因的检测。目的对临床上非小细胞肺癌患者经常发生的egfr信号途径相关基因突变进行检测,分析患者的突变情况与临床因素之间的联系。方法采集手术时nsclc患者新鲜肿瘤组织,提取基因组dna,经过特异性引物扩增后,用焦磷酸测序检测待测突变。结果1.56名患者肿瘤组织中,共有9名检出egfr19外显子缺失突变,8名检出21外显子l858r碱基替换,1名检出18外显子g719s/c突变;还有2名检出kras第12密码子突变,1名检出pik3ca的e545k点突变。综合看来,egfr的突变率为32.14%,kras的突变率为3.57%,pik3ca突变率为1.79%。2.nsclc患者肿瘤组织的egfr的突变率在不同病理分期、病理类型之间有显著性差异,p0.05。结论1.免提取cfdna定量pcr方法,具有较高的准确度及精密度,线性范围能够达到1-10000ng/ml,与试剂盒提取法相比,在定量结果稳定性、重复性等方面都有显著改善。2.基于LINE1基因的免提取定量PCR方法,能够很好地对NSCLC病人的血液循环DNA含量及完整性进行测定。3.非小细胞肺癌患者循环DNA含量显著高于健康人;NSCLC病人cfDNA含量、完整性指数(DII)与患者的病理分期相关,分期越早,含量及完整性越低,提示检测此标志物水平有助于评估疾病的严重程度;cfDNA含量用于诊断NSCLC的灵敏度是72.3%,特异度是59.5%,cut-off值为87.5 ng/ml,此时ROC曲线下面积是0.659。4.非小细胞肺癌肿瘤组织中主要检出的突变是EGFR突变,KRAS和PIK3CA基因突变检出率较低。EGFR突变检出率与病理分期、病理类型都相关。分期越晚,检出率越高;腺癌的检出率最高。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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，本文编号：1166938
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