TIPE2通过IRF4调控胃癌细胞增殖机制的研究

发布时间：2017-11-11 00:00

  本文关键词：TIPE2通过IRF4调控胃癌细胞增殖机制的研究

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【摘要】：目的研究TLR信号通路负性调节因子TIPE2在胃炎到胃癌发生发展中的功能,并研究TIPE2通过诱导调控IRF4抑制胃上皮细胞增殖的分子机制,从而为胃癌疾病的发生发展提供了新线索。方法1.组织水平上,以免疫组织化学方法检查不同程度胃炎组织,胃癌组织中TIPE2蛋白表达 情况。同时提取组织的RNA,通过qRT-PC R方法检测mRNA水平上TIPE2的表达；提取TIPE2基因敲除小鼠肝、肾、小肠、心脏、胃等器官组织的RNA,利用W estern blot方法检测蛋白水平上IRF4表达,同时通过qRT-PCR方法检测mRNA水平上IRF4的表达情况。2.细胞水平上,通过转染人TIPE2高表达的质粒pRK5-tipe2进入胃上皮细胞系,使得细胞内过表达TIPE2,检测TIPE2在胃癌上皮细胞增殖中的作用：(1)质粒转染：将人TIPE2高表达质粒pRK5-tipe2及其对照质粒pRK5-mock转染胃上皮细胞系AGS,分别于48小时、72小时后收集细胞,提取RNA和蛋白质。通过Western blot口qRT-PCR分别在蛋白水平和mRNA水平检测TIPE2的表达,并评估质粒转染的效率。(2)细胞增殖能力检测：以2ug、4ug、8ug的浓度梯度转染TIPE2表达质粒pRK5-tipe2以及对照质粒pRK5-mock进入AGS细胞,于48小时进行细胞计数,以每孔300个细胞的比例加入六孔板中,培养至形成肉眼可见的克隆群落,比较两组的差异。(3)研究TIPE2对细胞周期的影响：TIPE2表达质粒pRK5-tipe2 和 pRK5-mock对照质粒进入AGS细胞24小时、48小时、72小时,以流式细胞术分析这些细胞所处周期的变化。(4)生物芯片分析TIPE2抑制增殖可能的分子机制：AGS细胞在转染TIPE2高表达质粒后,进行表达谱生物芯片分析,并以Western blot和qRT-PCR方法对显著变化的靶基因机器通路相关分子在蛋白和mRNA水平进行验证。(5)小干扰RNA转染：转染TIPE2表达质粒pRK5-tipe2对照质pRK5-mock粒进入AGS细胞,24小时后部分AGS细胞分别转染小干扰小时后,IRF4 RNA,48收集蛋白及提取RNA,并以口Western blot方法检测IRF4蛋白和qRT-PCR水平,同时也检测TIPE2蛋白与mRNA水平验证基因敲减效率。mRNA(6)通路抑制剂：对AGS细胞系分别加入不同信号通路特有的抑制剂,72小时后收集蛋白质检测蛋白水平IRF4的变化,判断TIPE2用以调节IRF4的信号通路。结果1.免疫组化结果显示TIPE2在胃部的正常组织高表达,但在胃部慢性炎症组织中表达降低而且与炎症的严重程度呈负相关,在胃癌组织中无表达；并且qRT-PCR在mRNA水平验证了免疫组化的结果,证明在胃部疾病发生发展时TIPE2表达发生变化并且随疾病的进展程度呈现负相关。2.胃上皮细胞转染TIPE2表达质粒后,在蛋白质水平上TIPE2表达量明显升高；同时能够检测到细胞克隆形成能力明显受到抑制。3.流式细胞术结果显示TIPE2过表达能够抑制S期细胞的比例,使细胞停留在G1期,表明TIPE2通过抑制细胞进入S期而抑制上皮细胞增殖。4.生物基因芯片以及蛋白质分析结果表明,IFR4表达水平与TIPE2转染呈现剂量依赖性；敲除TIPE2基因的小鼠器官组织内IRF4表达下调。5.通过转染IRF4小干扰RNA进一步验证TIPE2是通过调控IRF4表达来发挥抑制细胞增殖的作用6.通路抑制剂结果显示TIPE2通过NF-KB信号通路调节IRF4表达。结论1.在胃炎和胃癌组织内TIPE2表达下调与疾病的发展呈负相关。2.TIPE2通过降低胃上皮细胞进入S期从而达到抑制细胞增殖的作用。3.TIPE2通过NF-KB信号通路调节IRF4表达进而发挥肿瘤抑制的功能。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

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本文编号：1168891