Ese-3基因表达对结肠癌细胞HCT15增殖的影响

发布时间：2017-11-12 09:16

  本文关键词：Ese-3基因表达对结肠癌细胞HCT15增殖的影响

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【摘要】：背景结肠癌是我国临床常见的消化道恶性肿瘤,发病率逐年升高并呈年轻化趋势。由于结肠癌患者发病隐匿,确诊时往往已是中晚期,在临床实践中很多结肠癌术后患者在接受多次放、化疗后,出现化疗耐药,从而无法有效控制局部复发、远处转移,导致最终死于本病。越来越多的临床实践证实分子靶向药物在肿瘤治疗中的优势,因此,寻找新的治疗靶分子、研究靶分子作用机制等已成为结肠癌等肿瘤治疗取得突破的希望所在。既往研究表明,Ese-3基因与肿瘤的发生密切相关,在多种恶性肿瘤中表达缺失或下调,提示Ese-3基因很有可能成为肿瘤治疗的新靶点。但是国内外关于Ese-3基因在结肠癌细胞中的作用及其机制研究文献报道甚少。目的通过免疫组化等实验方法检测Ese-3基因在结肠及结肠癌中的表达差异性情况,通过慢病毒介导的生物转染技术构建稳定表达Ese-3基因的结肠癌细胞株HCT15-Ese3,观察该基因对细胞的增殖能力、克隆形成能力以及细胞周期、凋亡等增殖相关生物学特性的影响。以此初步探索Ese-3基因在结肠癌发生中的作用和作为潜在治疗靶点的可能性。方法运用免疫组织化学SP法对结肠癌患者术后病理标本进行染色,检测Ese-3基因在结直肠癌患者肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异性情况;在结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞中,通过Western-Blot、realtime-q PCR方法检测Ese-3蛋白的表达情况;采用慢病毒介导的转染技术构建稳定过表达Ese-3基因的细胞及相应对照细胞,运用细胞计数法、平板克隆形成实验、流式细胞仪等方法分别检测过表达Ese-3的HCT15细胞及对照细胞的增殖速度、克隆形成能力及细胞周期。结果(1)免疫组织化学染色结果显示:Ese-3蛋白在结肠癌及癌旁组织之间的表达具有显著差异性(P0.05)。在正常的结肠癌旁组织中,可见Ese-3呈棕黄色或棕褐色阳性表达,阳性颗粒主要定位于细胞核中,而在相应的结肠癌组织中Ese-3多呈阴性表达。(2)Western-Blot结果显示:Ese-3蛋白在正常结肠上皮细胞(FHC)内明确表达,而在结肠癌细胞中未见表达(HCT116、HCT15、SW480)或低表达(HCT8、SW620)。(3)q PCR方法检测结肠正常上皮FHC中Ese-3扩增产物的特异性,分析结果提示扩增曲线为S型,呈明显的指数扩增期;熔解曲线分析显示Ese-3为扩增产物中唯一的扩增子。计算基因表达量结果显示Ese-3在结肠正常上皮FHC中的表达丰度为中度。(4)细胞计数法绘制细胞增殖曲线发现,慢病毒载体LV-Ese-3感染的HCT15细胞与空载体对照组相比,细胞数目显著减少,说明上调Ese-3的表达,结肠癌细胞增殖速度明显减慢。(5)克隆形成实验结果显示,慢病毒载体LV-Ese-3感染HCT15细胞后,与阴性对照组相比,细胞的克隆形成能力显著下降。(6)流式细胞仪检测细胞周期结果表明,慢病毒过表达Ese-3后,HCT15细胞G0/G1期百分率增加到62.73%,S期减少到21.72%,与相应对照HCT15-NC细胞G0/G1期48.60%、S期32.67%相比,差异有显著性(P0.05)。结论我们的研究结果表明,Ese-3基因在结肠及结肠癌中表达具有差异性,即Ese-3基因在结肠癌中表达下调或缺失,并通过体外实验初步证实了Ese-3基因抑制结肠癌细胞HCT15细胞增殖、降低了细胞克隆形成能力、抑制细胞进入S期的作用,提示Ese-3作为抑癌基因其表达的下调或缺失可能与结肠癌的发生有关,为结肠癌的临床分子靶向治疗提供重要的理论及实验依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

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本文编号：1175267