APOBEC3基因家族的生物学功能及其作用机制的初步研究

发布时间：2017-11-12 10:00

  本文关键词：APOBEC3基因家族的生物学功能及其作用机制的初步研究

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【摘要】：肿瘤发生的过程中涉及多种基因的异常,基因组不稳定性是造成肿瘤发生的关键,其中占人体基因组的17%的LINE-1(L1)被认为在此过程中起着重要的作用。L1是自主性逆转座子,在漫长的进化过程中被认为是早期整合到基因组中的内病毒。L1有两个开放的阅读框架(ORF),编码蛋白包括ORF-1p和ORF-2p两个蛋白,其中ORF-2p具有逆转录酶活性,而ORF-1p的功能仍不清楚,L1逆转座子的激活几乎在所有癌症中均能检测到,是导致基因组不稳定性的主要因素,其与癌症发生密切相关。正因如此,细胞在长期进化过程中形成了对LINE-1严格的限制措施,如通过对其启动子的超甲基化,抑制其激活,但细胞在应激条件仍可导致其激活,针对这种状况,细胞中的APOBEC3家族(A3s,包括A3B,A3C,ASF, A3G, A3H)被发现可通过造成DNA突变的方式,实现对其活性的限制。A3s家族基因是一类具有功能的应激应答基因,当细胞受到病毒等应激刺激,可促进其基因的表达,该家族基因的作用机制是造成单链DNA中的TCW (W代表A或者T)处的胞嘧啶脱氨,结果使胞嘧啶转变为胸腺嘧啶,从而导致DNA序列的突变。研究发现A3s在限制LINE-1基因活性以及一些逆转录病毒活性的同时,也会造成细胞基因组的其它基因的突变,这样LINE-1与A3s基因家族的之间博弈,很有可能是导致肿瘤基因组出现高频率突变的原因,为此,我们通过体外实验探索A3s对细胞生物学特征的影响以及可能的作用机制。 目的：研究A3s基因家族对细胞生物学特征的影响以及在肿瘤发生过程中的作用及其作用机制。 方法：(1)从Hela细胞或A549细胞中提取RNA,通过RT-PCR方法制备A3s基因,测序证实后连接到表达载体pcDNA3.1(+)上。(2)在探究A3s的生物学功能方面,将构建的A3s基因重组表达载体转染到人胚肾细胞HEK293中,使用WesternBlot鉴定其表达,分别通过细胞划痕实验、CCK-8实验、流式细胞仪检测分析真对HEK293细胞迁移、增殖、细胞凋亡和周期的影响。(3)A3s在肿瘤发生过程中的作用及其作用机制的研究方面：本研究探索了A3s家族蛋白与L1ORFlp之间形成蛋白复合体的可能性,由于L1ORFlp为RNA结合蛋白,进一步探索RNA在其中的作用。在探索其对重要癌相关基因的致突变研究中,通过共转染A3s家族基因以及TP53基因及其启动子区、K-RAS基因后,采用3D-PCR (Differential DNA Denaturation PCR)检验突变情况。 结果：通过对A3s基因家族的实验,我们发现： A3s基因的生物学功能：(1) CCK-8结果显示,A3B, A3C、A3F、A3G过表达能明显促进HEK293细胞的体外增殖能力。与空质粒转染相比,HEK293细胞的体外增殖能力得到极显著提高(P0.01),增长率分别为19.5%、19.9%、18.9%、15.7%;(2)AnnexinV-FITC、PI染色和流式细胞仪分析表明,A3B、A3C、A3F、A3G过表达能够抑制HEK293细胞的凋亡,在转染72h后,HEK293细胞的凋亡率分别为10.53%、19.02%、12.54%、13.95%,而转染空质粒组的凋亡率为21.31%; (4)PI染色和流式细胞仪分析表明A3B、A3C、A3、A3H过表达能使HEK293细胞G0/G1期缩短,而S期延长,促进HEK293细胞周期,此结果与细胞增殖实验结果一致。 A3s基因介导的调控机制：(1)co-IP结果表明,A3C、A3F、A3G与L1ORF-lp存在相互作用关系,当用RNA酶处理后,发现这种相互作用消失,表明A3C,A3F, A3G与L1ORF-1p的相互作用是RNA介导的；(2)HEK293分别共转染A3C、A3F、A3G与TP53、TP53的启动子区、K-RAS基因质粒探究TP53、K-RAS基因突变的产生的机制,结果显示A3s过表达可增加TP53结构基因以及启动子区序列产生突变,而对K-RAS突变无明显影响。(3)荧光素酶报告基因实验显示：A3F-HA能下调TP-53启动子活性,而A3G-HA上调TP-53启动子活性。 结论：上述结果证明,人胚肾HEK293细胞中A3s基因表达水平的升高可增强细胞的体外增殖,抑制细胞的凋亡,并造成周期的改变；机制研究发现,APOBEC3蛋白可通过RNA依赖的方式与IJNE1ORF-lp发生相互作用,这为进一步研究LINE1逆转座子和A3s家族在肿瘤中的作用提供了实验基础。此外,实验中发现APOBEC3可能诱导TP53、TP53启动子区发生基因突变,且能引起TP53启动子活性改变,而对K-RAS基因没有影响,这对A3s诱导基因突变的机制以及其在肿瘤中的作用研究有着重要的意义。
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2

【共引文献】

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本文编号：1175392