FBXW7新的靶蛋白ENO1的鉴定及功能研究

发布时间：2017-11-13 01:29

  本文关键词：FBXW7新的靶蛋白ENO1的鉴定及功能研究

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【摘要】：研究背景FBXW7也称 FBW7,是F-box蛋白家族成员,为SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素连接酶体系的靶蛋白识别组分。人FBXW7基因定位于4号染色体(4q31.3),其表达产物FBXW7的F-box基序和SKP1直接结合,形成SCFFBXw7复合体,并通过其WD40结构域识别特异性底物,介导靶底物的泛素化降解。FBXW7可靶向降解多种癌蛋白,如Cyclin E、 c-Myc、mTOR、Notch1、HIF-1α等,在细胞周期进程、细胞生长、分化、细胞凋亡、肿瘤转移、肿瘤抗药性等多个方面发挥重要调控作用。FBXW7是公认的肿瘤抑制基因,在多种肿瘤中包括肺癌、胃癌、前列腺癌等存在功能性突变、缺失或表达降低。目前,FBXW7抑制肿瘤的机制尚不完全清楚,而其通过调控特定靶蛋白的含量参与肿瘤抑制作用是最常见的机制。迄今为止,已经鉴定的FBXW7底物比较局限,而FBXW7作用的靶底物不同,其抑癌机制也不同。因此,发现、鉴定FBXW7未知的靶底物,研究其与靶底物的作用方式,对进一步明确FBXW7的抑癌机制有非常重要的意义,同时也为阐明FBXW7与其他肿瘤相关基因的调控及其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。烯醇酶1(enolase1, ENO1)是糖酵解过程中催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸的代谢关键酶,最终促进乳酸及ATP的生成。多项研究表明,除了参与糖酵解过程外,ENO1是体内重要的多功能蛋白,参与细胞生长调控、缺氧耐受、自身免疫调节等多种生理过程。现有的研究报道ENO1在鼻咽癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中表达增高,且其表达水平的高低和肿瘤的发展及不良预后有关；在细胞中过表达ENO1能够促进细胞增殖,侵袭和转移,表明ENO1可能作为一个癌蛋白促进肿瘤的发生发展。然而,目前对于ENO1的具体表达调控机制尚不清楚。我们在前期研究中以筛选鉴定FBXW7的靶蛋白为研究目标,利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)与质谱技术(MS)分离鉴定FBXW7基因敲除大肠癌细胞系HCT116 FBXW7-/-和FBXW7野生型HCI116 FBXW7+/+中差异表达的蛋白质,结果发现体外敲除大肠癌细胞FBXW7的表达可明显上调ENO1的表达,提示ENO1可能是FBXW7新的靶底物。本研究进一步从体外细胞实验和人结直肠癌组织标本两个层面深入探讨了FBXW7对ENO1的调控作用及调控机理,该研究的完成发现和确认了新的FBXW7靶蛋白,揭示了FBXW7参与肿瘤发生发展过程的新机制,为肿瘤的诊断和治疗提供新的思路和靶点。研究目的探讨FBXW7对ENO1表达的调控作用及作用机理,并进一步阐明FBXW7通过调控ENO1影响肿瘤的发生和发展。研究方法1.在多个细胞系及临床组织标本中确定FBXW7对ENO1的调控作用1)在FBXW7野生型结肠癌细胞HCT116 FBXW7+/+和DLD-1 FBXW7+/+及利用同源重组技术建立的FBXW7基因敲除的HCT116 FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7-/-细胞中,应用qRT-PCR和Western blotting检测ENO1的表达。2)在前列腺癌细胞系PC3、Du145和乳腺癌细胞系MDA-MB-468中,通过RNA干扰技术建立FBXW7沉默表达的稳定细胞系,应用qRT-PCR和Western blotting检测ENO1的表达。3)在HCT116 FBXW7-/-和HEK293细胞中转染FBXW7真核表达载体,Western blotting检测ENO1的表达。4)收集50例结直肠癌及癌旁组织,免疫组织化学方法检测FBXW7和ENO1的表达,分析两者的相关性。2.进一步实验确定FBXW7调控ENO1蛋白水平的机理1)运用蛋白质免疫共沉淀技术检测FBXW7和ENO1之间的相互作用。2)在HCYU6 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞中,应用放线菌酮示踪实验检测FBXW7对ENO1半衰期的影响。3) 应用蛋白酶体抑制剂MG132处理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞,Western blotting检测ENO1水平的改变。4) 应用GSK3β特异的抑制剂GSK3β inhibitor Ⅷ处理HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-细胞,Western blotting检测ENO1水平的改变。5) 运用蛋白质免疫共沉淀技术检测FBXW7表达变化对ENO1的泛素化水平的影响。3.检测FBXW7调节ENO1的功能进而影响细胞的增殖和迁移1) 应用ENO1特异的干扰RNA沉默FBXW7和FBXW-/-细胞中ENO1的表达,qRT-PCR检测各组细胞中CCL20 mRNA的表达。2) 应用ENO1特异的干扰RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-细胞中ENO1的表达,ATP及乳酸检测试剂盒检测细胞内ATP及乳酸的含量,检测FBXW7调控ENO1对细胞糖酵解代谢途径的影响。3) 在ENO1过表达的HCT116 FBXW7+/+细胞中过表达FBXW7或在FBXW7敲除的HCT116 FBXWT7-/-细胞中沉默ENO1的表达,运用MTT和划痕实验检测FBXW7调控ENO1对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。研究结果1. FBXW7显著下调ENO1蛋白的表达1) Western blotting检测结果显示FBXW7基因敲除或沉默的细胞系中ENO1蛋白的表达显著增加,而qRT-PCR结果显示FBXW7基因敲除或沉默的细胞系中EN01 mRNA的表达没有显著性差异。2) Western blotting检测结果显示在293T和HC1116FBXW7-/-细胞中过表达FBXW7, ENO1蛋白表达显著降低。3)免疫组织化学实验结果显示结肠癌组织中FBW7和ENO1水平成明显的负相关。2. FBXW7促进ENO1通过蛋白酶体途径降解1)蛋白质免疫共沉淀检测结果显示FBXW7和ENO1存在相互结合的作用。2)放线菌酮示踪实验结果显示FBXW7缺失延长ENO1蛋白的半衰期,FBXW7促进ENO1降解。3) Western blotting结果显示蛋白酶体抑制剂MG132和GSK3β inhibitorⅦl阻断FBXW7缺失诱导的ENO1的表达升高。4)蛋白质免疫共沉淀检测显示FBXW7可以促进ENO1的泛素化。3. FBXW7调节ENO1的功能影响细胞CCL20mRNA、 ATP和乳酸产生及增殖和迁移能力1)qRT-PCR结果显示FBXW7通过负性调控ENO1抑制细胞CCL20的表达。2)ATP及乳酸含量检测显示FBXW7通过负性调控ENO1抑制细胞ATP和乳酸的产生。3)MTT和划痕实验结果显示FBXW7通过负性调控ENO1抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。研究结论和意义我们的研究结果表明FBXW7可以通过靶向降解ENO1,负性调控ENO1的功能从而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。目前的研究不仅鉴定了FBXW7新的靶蛋白,而且发现ENO1新的调控机制,有助于我们进一步理解FBXW7/ENO1参与调控肿瘤发生发展的分子机制,为肿瘤的治疗提供新的靶点。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730

【参考文献】

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1 李宝国;;结肠癌诊治的回顾与展望[J];齐齐哈尔医学院学报;2010年13期

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本文编号：1178526