EMT在非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药中的作用及机制研究

发布时间：2017-11-13 02:29

  本文关键词：EMT在非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药中的作用及机制研究

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【摘要】：研究背景和目的肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,已经成为癌症病人死亡的最常见原因。近年来,分子靶向治疗成为研究热点并运用于临床,以吉非替尼为代表的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)已经用于EGFR (epidermal growth factor receptor,EGFR)突变型晚期NSCLC的一线、二线治疗,对EGFR野生型NSCLC的有效率也达到5%-6%,然而耐药现象的出现成为制约EGFR-TKIs进一步应用的瓶颈,使使用EGFR-TKIs治疗的患者的中位无进展时间仅为8～10个月。因此,研究和发现EGFR-TKIs获得性耐药机制,积极寻找逆转耐药的新方法具重要的临床意义。目前认为,EGFR突变型NSCLC细胞对EGFR-TKIs获得性耐药的主要相关机制为EGFR基因的二次突变(20外显子T790M突变)及Met基因的扩增,二者所占比例分别为50%和20%左右,其中约10%重叠,故这两种机制覆盖了约60%的EGFR-TKIs获得性耐药[3-7]。但仍有约40%的EGFR突变型NSCLC的获得性耐药机制以及EGFR野生型NSCLC的获得性耐药机制尚未明确,其中可能包括EGFR以外的酪氨酸激酶受体(如IGF-1R等)信号传导通路的激活、EGFR下游信号通路中的分子异常活化、肝细胞生长因子(HGF)过表达、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的缺失、EML4-ALK融合基因及细胞EMT的发生等。本课题组的前期研究已证实,EGFR野生型的NSCLC细胞H460在EGFR-TKIs获得性耐药过程中发生了EMT,提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC获得性耐药过程中起重要作用。上皮间质转化(Epithelial- mesenchymal transi ion,EMT),是上皮细胞失去上皮特性,获得间质细胞表型的一种生物现象,发生EMT后,细胞E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降低,波形蛋白、纤维连接素、N-钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移、药物耐药有密切关系,且与NSCLC的预后及对EGFR-TKIs敏感性密切相关[13-16]。Thomson等]对EGFR野生型NSCLC细胞的研究显示,表达E-cadherin/beta-catenin的NSCLC细胞对EGFR-TKIs敏感,而表达vimentin/fibronectin的NSCLC细胞则对EGFR-TKIs不敏感。Rho等通过建立吉非替尼耐药肺癌细胞亚株(A549/GR),对比A549细胞株,A549/GR细胞株对吉非替尼的耐药性为A549细胞株的7.7倍；进一步发现,A549/GR细胞表现出EMT表型特点。厄洛替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株H460和Calu6上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达降低,而厄洛替尼敏感细胞株H292的E-cadherin则呈现高表达。吉非替尼耐药的肺癌细胞株H157、H1730、A549、H520上皮细胞标志蛋白E-cadherin、上皮细胞粘附分子EpCAM、紧密连接体蛋白claudin4和caludin7的表达普遍较低,而吉非替尼敏感细胞株H322、H358、H1648这些蛋白表达则增高[19-21]。Yauch等的研究发现,不论在EGRF野生型还是EGFR突变型的NSCLC细胞,E-cadherin表达均与细胞对EGFR-TKIs敏感性密切相关。用基因转染增加E-cadherin表达可提高肿瘤细胞对EGFR-TKIs治疗的敏感性。与基础研究结果一致,E-cadherin表达水平可作为预测NSCLC患者对EGFR-TKIs临床疗效的一个新的生物学标记。一项观察EGFR-TKIs联合化疗治疗NSCLC的国际多中心随即III期临床研究结果显示：E-cadherin表达阳性的患者疾病进展时间明显延长。吉非替尼一线治疗NSCLC, E-cadherin表达阳性的患者总生存显著长于E-cadherin表达阴性的患者。多种转录因子密切参与了EMT的发生,目前发现Snail、Slug、Twist、 ZEB1、Smad、NF-B等。研究发现,EMT相关转录因子(ZEB1、slug)在吉非替尼获得性耐药的过程中也起到关键性的调控作用,靶向消除Slug的表达能逆转耐药细胞株的间质化特征,恢复耐药细胞株对吉非替尼的敏感性。对于NSCLC细胞发生EMT后EGFR-TKIs治疗敏感性下降的分子细胞学机制目前尚未阐明。有研究显示,EMT可能降低了肿瘤细胞生长或增值对EGFR信号通路的依赖性,间质表型细胞可产生持续的Akt激活,引发了非EGFR依赖性PI3K/Akt信号通路激活,从而导致了肿瘤细胞对厄洛替尼等EGFR-TKIs治疗的不敏感。目前,关于EMT参与NSCLC细胞EGFR-TKIs获得性耐药的具体作用机制有待进一步深入研究阐明。因此,在课题组前期工作的基础上,本课题拟通过构建靶向CDH1基因的过表达慢病毒表达载体感染EGFR野生型和突变型NSCLC细胞,提高E-cadherin的表达水平,逆转细胞的EMT,观察耐药细胞对EGFR-TKIs的敏感性变化,探讨EMT在NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药中的作用及其可能的分子学机制,为提高EGFR-TKIs疗效寻找新靶点和新方法。方法1、选用EGFR突变型的人肺腺癌细胞PC/9及其吉非替尼耐药细胞PC9/AB。高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high-resolution melting, qPCR-HRM)检测PC9/AB细胞EGFR及Kras基因突变；MTT法检测两组组细胞的增殖情况；划痕实验和Transwell实验检测细胞转移和侵袭能力的改变；Western blot方法检测两组细胞的EGFR、p-EGFR、E-cadherin. Vimentin、Snail等的蛋白水平的表达变化。2、利用GV218质粒构建靶向CDH1 (NM-004360) (E-cadherin基因)的过表达载体和阴性对照载体,并用PCR电泳鉴定和基因测序；经过鉴定测序的构建好的载体质粒转染293T细胞,用Western Blot外源筛选有效过表达载体；选择转染效果良好的慢病毒载体进行包装并测定滴度；慢病毒感染目的细胞H460/ER和PC9/AB,并确定转染效率；用实时荧光定量PCR和Western Blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测对目的基因CDH1的过表达效应。3、CDH1基因稳定过表达后,观察细胞的形态变化,划痕实验和Transwell实验检测H460/ER、PC9/AB细胞转移和侵袭能力的改变；Western Blot检测H460/ER、PC9/AB细胞E-cadherin、Vimentin、Snail的表达变化。4 CDH1基因稳定过表达后,MTT法测H460/ER、PC9/AB对的增殖情况变化,Western blot方法检测EGFR及其磷酸化蛋白的表达变化。5、统计方法采用SPSS13.0软件进统计学分析,结果数据以X±s表示。两组间比较采用t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果1、PC9/AB细胞和H460/ER细胞的EGFR和K-ras基因突变状况基因突变检测结果显示,PC9/AB细胞为EGFR基因19号外显子缺失突变型及K-ras基因野生型,无T790M突变及cMET基因扩增。前期研究结果显示,H460/ER细胞为EGFR基因及K-ras基因野生型。2、PC9/AB细胞对EGFR-TKIs敏感性下降MTT法检测结果显示,PC9、PC9/AB细胞均呈无限繁殖。PC9/AB细胞对吉非替尼的增殖作用显示为浓度依赖性作用,PC9/AB细胞对厄洛替尼的敏感性较PC9细胞显著下降,IC50值分别为7.23±6.89 μ mo1/L和0.04±0.00 μ mo1/L(P005)。该结果说明,PC9/AB细胞对EGFR-TKIs产生了获得性耐药。3、PC9/AB细胞的形态学变化PC9/AB的细胞形态改变与PC9细胞相比,PC-9/AB细胞形态倾向梭形发展,细胞间连接变得更加疏松,符合间质细胞形态学表现。4、PC9/AB细胞的迁移及侵袭能力变化划痕实验结果显示,PC9/AB划痕两边缘距离均明显缩短。侵袭实验结果显示,PC9/AB穿过Matrigel胶的细胞数明显高于原亲本细胞。5、PC9/AB的EMT相关分子和EGFR在蛋白表达的变化western blot结果显示,vimentin、snail的蛋白表达水平均明显增加,差异均有统计学意义(P0.05)。EGFR、E-cadherin、β-catenin的蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05)。以上结果表明,PC9细胞发生获得性耐药后,发生了EMT,且EGFR及其磷酸化蛋白表达降低。6、CDH1基因慢病毒过表达载体的构建针对CDH1基因成功构建了2条过表达慢病毒载体LV-CDH1 (5386-1)-P1、 LV-CDH1(5386-1)-P2以及阴性对照载体CON136; q-PCR法外源筛选出有效过表达慢病毒载体LV-CDH1(5386-1)并进行病毒包装,获得了较高滴度的慢病毒颗粒；感染结果显示该慢病毒载体能稳定高效转染H460/ER和PC9/AB细胞。Q-PCR方法Western blot结果表明LV-CDH1(5386-1)慢病毒对H460/ER细胞的CDH1基因的mRNA水平提升了约16倍,蛋白表达水平明显升高,LV-CDH1(5386-1)慢病毒对PC9/AB细胞的CDH1基因的mRNA水平提升了约4倍,蛋白表达水平明显升高。7、高表达E-cadherin后的H460/ER和PC9/AB细胞形态变化与阴性对照细胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞形态倾向椭圆形发展,细胞间连接变得紧密,符合上皮细胞形态学表现。8、高表达E-cadherin后细胞的迁移和侵袭能力变化划痕实验结果显示,与阴性对照细胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞的划痕两边缘距离均明显增宽。侵袭实验结果显示,阴性对照细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显高于PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞。以上结果表明,高表达E-cadherin后,PC-9/AB和H460/ER细胞的细胞侵袭和迁移能力均明显降低。9、高表达E-cadherin后细胞EMT相关分子的蛋白水平变化与阴性对照细胞相比,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞的vimentin、 snail的蛋白表达水平均明显降低,差异有统计学意义(P0.05)；E-cadherin、β-catenin的蛋白表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果表明,高表达E-cadherin后,细胞发生了去EMT的变化。10、高表达E-cadherin后细胞对EGFR-TKIs的敏感性变化MTT结果显示,PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞均呈无限繁殖。吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9/AB-CDH1细胞生长,该抑制作用呈浓度依赖性；PC9/AB-CDH1与阴性对照细胞相比,对吉非替尼的敏感性增加约11.4倍,IC50值分别为(0.70±0.22)μmol/L和(8.68±0.44)μ mol/L,差异有统计学意义(P0.05)。厄洛替尼(10～100μmol/L)可抑制H460/ER-CDH1细胞生长,该抑制作用呈浓度依赖性；H460/ER-CDH1与阴性对照细胞相比,对厄洛替尼的敏感度增加约6.1倍,IC50值分别为(7.51±1.12)μmol/L和(53.72±12.95)μ mol/L,差异有统计学意义(P＜0.05)。11、高表达E-cadherin后细胞EGFR基因蛋白水平上的变化western blot结果显示,EGFR、p-EGFR蛋白表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论本研究发现：NSCLC细胞在产生EGFR-TKIs耐药的过程中出现了EMT。逆转耐药细胞的EMT可提高NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性,上皮间质转化在NSCLC对EGFR-TKIs的获得性耐药中起重要作用,其机制可能与EGFR磷酸化水平降低有关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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1 张曦;张为民;陈蓓;;RNAi介导IGF-1R基因沉默对非小细胞肺癌PC-9/ZD细胞株EMT的影响[J];山东医药;2014年23期

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本文编号：1178727