新型全反式维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响及其分子机制的研究

发布时间：2017-11-13 13:42

  本文关键词：新型全反式维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响及其分子机制的研究

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【摘要】：目的研究新型全反式维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate, ATPR)对人肝癌细胞株HepG2体外增殖的影响,并初步探究可能的机制。方法使用人肝癌HepG2细胞为研究模型,全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和ATPR分别处理细胞后,MTT法检测细胞活力；平板克隆实验检测细胞体外克隆形成能力：为更明确ATRA和ATPR对HepG2增殖的作用,使用流式细胞术测定细胞周期分布；Hoechst染色检测细胞凋亡情况。此外,为初步探讨潜在的分子机制,细胞免疫荧光法检测肿瘤抑制因子p53蛋白的表达和定位情况。实时定量逆转录PCR (qRT-PCR)和Western blot分别检测p53基因转录和蛋白翻译水平；Western blot法检测MDM2 (murine double minute 2), p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimμlating protein of p53, ASPP)家族,周期相关蛋白(p21、周期蛋白(cyclin)D、cyclinE,周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)4、CDK6)和凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和caspase-3)的表达情况。最后,为分析ATRA和ATPR对核内维甲酸受体的影响,Western blot检测了维甲酸受体(retinoic acid receptors, RARs)和维甲酸类X受体(retinoid x receptors, RXRs)的表达。结果MTT结果显示,ATRA和ATPR均可以抑制人肝癌细胞株HepG2的生长活力,且具有浓度和时间依赖性,但在同浓度、同一处理时间下,ATPR较ATRA的抑制率更高。平板克隆实验和流式细胞术显示,ATPR可显著抑制HepG2细胞的克隆形成能力,并将细胞阻滞在G0/G1期,而ATRA无明显抑制作用。Hoechst染色显示,ATPR可以诱导HepG2细胞的凋亡,免疫荧光显示,ATPR组的p53蛋白在细胞核内的荧光密度增加,同样地,qRT-PCR和Western blot也表明ATPR能够增强p53 mRNA和蛋白的表达水平。此外,ATPR能够上调ASPP1、p21、Bax和caspase-3的水平,下调MDM2、iASPP、cyclinD、CDK6、cyclinE和Bcl-2的水平,而ASPP2和CDK4的表达无明显变化。对于维甲酸受体蛋白的表达,Western blot结果显示,与细胞对照组相比,ATRA和ATPR均能够增加RARα以及减少RXRβ和RXRγ的表达,但ATPR作用更显著,而RARy和RXRa的表达在各组之间无明显变化。此外,ATRA可以明显降低RARβ的表达量,而ATPR对其表达无明显影响。结论在同浓度、同等作用时间下,与ATRA相比,ATPR对人肝癌细胞株HepG2的体外增殖抑制作用更强。其作用机制可能是ATPR通过结合不同的维甲酸受体后,上调p53的转录、翻译和ASPP1的表达水平,以及下调MDM2和iASPP表达,来调控下游凋亡和周期相关蛋白,进而引起G0/G1期阻滞和细胞凋亡。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1180953