Snf5和Ezh2调节细胞自噬的实验研究

发布时间：2017-11-13 14:43

  本文关键词：Snf5和Ezh2调节细胞自噬的实验研究

  更多相关文章： 自噬 恶性横纹肌样瘤 小鼠胚胎成纤维细胞 Snf5 Ezh2 LC3

【摘要】：目的:探讨染色体重塑复合物SWI/SNF核心亚基Snf5和组蛋白甲基化酶Ezh2调控自噬发生的作用和作用机制。方法:第一部分:取基因型均为Snf5flox/flox的雄鼠和雌鼠合笼交配,通过阴道栓确认怀孕,13天后解剖怀孕母鼠取出胚胎,制备基因型为Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纤维细胞,进行体外培养、传代,并冻存细胞。将腺病毒表达质粒YFP-Cre和包膜质粒10A1共转染入人肾上皮细胞系293t细胞,包装出腺病毒,使用病毒液感染制备好的基因型为Snf5flox/flox的小鼠胚胎成纤维细胞。流式筛选出Snf5-/-细胞,利用EBSS培养液对细胞进行饥饿处理,Western Blot实验检测细胞中自噬标记LC3-I、LC3-II表达量变化,检测自噬水平变化。第二部分:利用已有的小鼠胚胎成纤维细胞中敲除Snf5基因后的基因表达谱芯片数据,进行基因集富集分析。选取Snf5缺失的BT12、G401恶性横纹肌样瘤MRT(malignant rhabdoid tumor)细胞系,以Hela子宫颈癌细胞系作为对照,分别使用EBSS培养液对细胞进行梯度时间饥饿处理,Western Blot实验检测细胞中LC3-I、LC3-II表达量变化,检测自噬水平变化。使用Ezh2小分子抑制剂EPZ6438,分别以一定的浓度梯度处理Snf5缺失的A204、G401细胞,Western Blot实验检测H3K27me3水平和LC3-I、LC3-II表达量变化,检测自噬水平变化。结果:第一部分:利用Cre-loxP系统,将包装好的表达Cre酶的腺病毒感染Snf5flox/flox小鼠胚胎成纤维细胞,流式细胞术筛选出Snf5-/-小鼠胚胎成纤维细胞,使用EBSS进行梯度时间饥饿处理后,Western Blot实验结果显示Snf5-/-小鼠胚胎成纤维细胞在饥饿处理0h时LC3-II水平就明显升高,提示在小鼠胚胎成纤维细胞中敲除Snf5可能诱导了细胞自噬的发生。第二部分:基因富集分析的结果显示,在敲除了Snf5小鼠胚胎成纤维细胞基因表达变化的排序中,成视网膜细胞瘤基因RB下游相关基因的基因集在顶端发生明显富集,而转录因子E2F的靶基因与自噬调控相关,揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信号通路异常影响了自噬。使用EBSS培养液对Hela、BT12、G401细胞系进行梯度时间饥饿处理,Western Blot实验结果显示,Hela细胞中LC3-II的水平无明显变化,而Snf5缺失的BT12、G401细胞中LC3-II水平在饥饿1h时就明显升高,揭示诱导自噬发生。EPZ6438是一种Ezh2小分子抑制剂,能够通过抑制Ezh2活性而降低H3K27me3的水平。Western Blot实验结果显示,使用EPZ6438处理A204、G401恶性横纹肌样瘤细胞系时,均在抑制剂浓度为10μM,处理96h后,H3K27me3水平明显降低,同时LC3-II的水平明显升高,揭示诱导自噬发生。结论:1、小鼠胚胎成纤维细胞的自噬可能是受Snf5调控的。敲除Snf5基因后,小鼠胚胎成纤维细胞自噬水平明显升高。2、在敲除了Snf5小鼠胚胎成纤维细胞基因表达谱变化排序中,并未发现自噬相关基因集在其顶部或底部富集,而结果显示,成视网膜细胞瘤基因RB下游相关基因的基因集在其顶部明显富集,揭示可能Snf5缺失引起的RB/E2F信号通路异常影响了自噬。3、饥饿诱导自噬,相较于子宫颈癌Hela细胞系,Snf5缺失的恶性横纹肌样瘤A204、G401细胞系具有较高敏感度的自噬活性,揭示干预MRT细胞自噬可能会发现新的治疗方向。4、在Snf5缺失的MRT细胞中,EPZ6438可以通过抑制Ezh2酶活性降低H3K27me3水平,使LC3-II表达水平增高,诱导自噬发生。揭示Ezh2催化的H3K27me3可能参与调节自噬,将Ezh2作为药物靶点并联合使用调控自噬类药物,可能会加强对MRT细胞的杀伤作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.7

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本文编号：1181144