紫衫烷化合物抑制肝癌细胞增殖活性及其机制研究

发布时间：2017-11-14 09:11

  本文关键词：紫衫烷化合物抑制肝癌细胞增殖活性及其机制研究

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【摘要】：随着紫杉醇及其前体物在临床上的广泛应用,导致其需求量不断增加,因此,新的生物资源的开发与寻找已经迫在眉急。近年大量的紫杉醇类似物被学者们提取分离得到,但是截止到目前,仍然没有第二代紫杉醇药物上市。所以,对于新的紫杉烷类药物的研究主要是寻找高效低毒以及对多种肿瘤细胞,尤其是对具有耐药性的人体肿瘤细胞有较高抑制活性的紫杉烷类化合物。本研究以从东北红豆杉和加拿大红豆杉可再生小枝和针叶中分离纯化的23种紫杉烷类化合物为象,检测了它们对人肝肿瘤细胞增殖的作用,筛选出三种可明显抑制人肝肿瘤细胞增殖的化合物,并对化合物Taxinine抗肿瘤的作用机制进行了初步探讨,这对于扩大紫杉药源,寻找和开发新的抗癌先导化合物或药物都具有非常重要的意义。第一部分紫杉烷类化合物体外抗人肝癌活性筛选目的:随着近年来对紫杉醇及其前体物的需求量不断攀升,为了缓解紫杉醇供不应求的局面,本研究以东北红豆杉和加拿大红豆杉可再生小枝和针叶中分离纯化的23种紫杉烷类化合物为研究对象,对人肝肿瘤细胞增殖抑制活性进行了筛选,以筛选出对肝肿瘤细胞具有明显抑制活性的化合物。方法:采用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测23种紫杉烷类化合物对人肝肿瘤细胞增殖的作用,筛选出具有明显抗人肝肿瘤细胞增殖作用的紫杉烷类化合物,并对药物的浓度-效应曲线以Hill数学模型拟合,计算药物的的半数抑制浓度(IC50值)。结果:10μmol/L的顺铂和10μmol/L紫杉醇作用于人肝肿瘤细胞(Hep G2)后,均显示了非常强的增殖抑制活性,增殖抑制率分别为71.02%和78.93%;10μmol/L的23种紫杉烷类化合物处理Hep G2细胞后,化合物taxine II(11)、taxinine L(20)和taxuspine F[13](22)1β-hydroxyl-taxinine[13]、22均显示出与顺铂和紫杉醇相似或者强于它们的细胞增殖抑制活性;其他20种化合物对Hep G2细胞的增殖则无明显抑制活性。通过肿瘤细胞增殖生存率对化合物11、20、22浓度的对数回归方程,得到三种化合物对Hep G2细胞增殖的IC50,分别为0.15、3.75和4.91μmol/L。结论:从东北红豆杉和加拿大红豆杉可再生小枝和针叶中分离纯化的3种紫杉烷类化合物11、20和22对人肝肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制活性;抗人肝肿瘤细胞的增殖活性不仅与紫杉烷类化合物的骨架结构有密切关系,而且还与C-5位的脂溶性肉桂酰基侧链密切相关。第二部分Taxinine抗癌作用机制研究目的:大量的研究报道中发现中国传统药物中的很多成分均具有明显的抗肿瘤活性,并且这些成分大多都是通过诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用的。第一部分实验中筛选出来了三种紫杉烷类化合物对人肝肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用。本部分实验将对其机制进行研究,以明确上述化合物是否通过诱导细胞凋亡而发挥其抗肿瘤细胞增殖活性。方法:1通过荧光素酶报告基因检测系统来检测凋亡信号通路中的相关报告基因Bax-Luc、p G13-Luc、h Noxa-Luc和p21-Luc以及胞内其他信号通路的相关报告基因Ig K-Luc、SRE-Luc、CRE-Luc和NFAT-Luc:的表达;2流式细胞术检测5μmol/L的紫杉烷类化合物Taxinine作用Hep G2细胞24h后细胞的凋亡;3 Western blot检测紫杉烷类化合物Taxinine作用Hep G2细胞后p53、Bax和Caspase-3的变化;4 MTT法检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对Taxinine抑制人Hep G2增殖的翻转作用。结果:1编号分别为11、20和22的的三种紫杉烷类化合物,以5μmol/L浓度处理Hep G2细胞,观察其对Hep G2细胞报告基因表达的影响。结果显示,对于Hep G2细胞,11号化合物可明显上调其胞内p53依赖的凋亡信号通路中的相关报告基因Bax-Luc、p G13-Luc、h Noxa-Luc和p21-Luc的表达,但是在其他信号通路的相关报告基因中如SRE-Luc、Ig K-Luc、NFAT-Luc和CRE-Luc,则没有明显作用,而另外两种化合物对相关报告基因均不显示诱导作用。2 Taxinine对Hep G2细胞凋亡的影响:5μmol/L的Taxinine处理Hep G2细胞24 h后,Hep G2细胞凋亡率为13.7%,与空白对照组5.8%比较,具有显著性差异(P0.05),提示Taxinine对Hep G2细胞的凋亡有促进作用。3 Taxinine对Hep G2细胞内p53蛋白、Bax蛋白和Caspase-3蛋白的上调作用:在5μmol/L的顺铂和Taxinine作用Hep G2细胞后,显示细胞内的p53、Bax和Caspase-3表达水平均显著上升。4 Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对Taxinine抑制细胞增殖的翻转作用:0.1、1、10μmol/L的顺铂和Taxinine处理Hep G2细胞,其细胞生存率分别为95.10%、66.37%、21.27%和79.82%、31.87%、7.38%;20μmol/L的Z-VAD-FMK与顺铂和Taxinine共同处理Hep G2细胞后,其细胞生存率明显上升,分别为100.00%、70.90%、36.34%和84.79%、45.67%、19.05%,Z-VAD-FMK能显著翻转Taxinine对Hep G2细胞的抑制作用。结论:紫杉烷类化合物Taxinine对人肝肿瘤Hep G2细胞有明显的诱导凋亡活性;Taxinine通过p53通路发挥抗人肝肿瘤Hep G2细胞增殖活性,p53增高,促进Bax增高,进一步引起Caspase-3增高,引起细胞凋亡;Z-VAD-FMK能够翻转Taxinine对Hep G2细胞的抑制作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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