BMP9通过调节乳腺癌细胞和前体脂肪细胞相互作用抑制乳腺癌的研究

发布时间：2017-11-19 12:33

  本文关键词：BMP9通过调节乳腺癌细胞和前体脂肪细胞相互作用抑制乳腺癌的研究

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【摘要】：目的将乳腺癌细胞MDA-MB-231与前体脂肪细胞3T3-L1共培养来模拟乳腺脂肪微环境,从体内和体外两个方面研究人类骨形态发生蛋白9对乳腺脂肪微环境中乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移的影响及其可能的分子机制。方法以恶性程度较高的乳腺癌MDA-MB-231细胞作为研究对象,将重组腺病毒AdBMP9 (以AdGFP作为对照)及干扰腺病毒AdsiBMP9(以AdRFP作为对照)感染MDA-MB-231细胞,构建重组MDA-MB-231/AdBMP9过表达细胞株(MDA-MB-231/AdGFP为对照细胞)及重组MDA-MB-231/AdsiBMP9干扰细胞株(MDA-MB-231/AdRFP为对照细胞),分别与前体脂肪细胞3T3-L1在Transwell体系中间接共培养3 d。实验分组如下：① MDA-MB-231细胞+3T3-L1细胞共培养作为空白组,以Co-Blank表示；② MDA-MB-231/AdGFP细胞+3T3-L1细胞共培养作为过表达对照组,以Co-AdGFP表示；③ MDA-MB-231/AdRFP细胞+3T3-L1细胞共培养作为干扰对照组,以Co-AdRFP表示；④MDA-MB-231/AdBMP9细胞+3T3-L1细胞共培养作为过表达实验组,以Co-AdBMP9表示；⑤ MDA-MB-231/AdsiBMP9细胞+3T3-L1细胞共培养作为干扰实验组,以Co-AdsiBMP9表示。针对共培养体系中的MDA-MB-231细胞：RT-PCR及蛋白质印迹技术检测其BMP9的过表达及干扰情况；通过MTT实验检测其增殖能力；Transwell实验和划痕愈合实验检测其迁移能力的变化；流式细胞术(FCM)检测其周期变化；免疫荧光检测其瘦素受体(OB-R)的表达；蛋白质印迹技术检测其瘦素(leptin)、瘦素长受体(OB-Rb)及短受体(OB-Rt)和leptin信号通路关键分子的表达情况。蛋白质印迹技术检测共培养体系中前体脂肪细胞3T3-L1的leptin表达水平;ELISA技术检测培养液中的leptin分泌水平。将前体脂肪细胞分别与各重组乳腺癌细胞以2.5×107：5×106/鼠的比例混合后,通过皮下注入裸鼠的体内,进行皮下成瘤。每隔5天测定一次瘤体大小,21天后将裸鼠处死,留取瘤组织做HE染色观察瘤体分化情况；免疫组织化学染色检测瘤体中leptin、c-Myc、CyclinD1、 MMP9、p-ERK1/2、p-STAT3的表达情况。结果①RT-PCR及蛋白质印迹结果显示BMP9过表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231/AdBM9及BMP9低表达的干扰细胞株MDA-MB-231/AdsiBM9构建成功；②与3T3-LI细胞共培养后,针对乳腺癌细胞的实验结果发现：MTT结果显示BMP9过表达组(Co-AdBMP9)的细胞增殖较对照组受到明显抑制(P0.05),Co-AdsiBMP9组的细胞增殖活力较对照组明显升高(P0.05)；流式细胞术(FCM)检测结果表明Co-AdBMP9组的细胞周期阻滞于G2/M期(P0.05)；划痕愈合实验发现48h后Co-AdBMP9组划痕愈合率较对照组显著降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9组划痕愈合率较对照组明显升高(P0.05)；Transwell迁移实验显示24h后Co-AdBMP9组乳腺癌细胞穿膜数显著低于对照组(P0.05),而Co-AdsiBMP9组肿瘤细胞穿膜数显著高于对照组(P0.05)；免疫荧光结果显示乳腺癌MDA-MB-231细胞瘦素受体OB-R表达阳性。Western blotting结果表明leptin、OB-Rb、OB-Rt表达水平在Co-AdBMP9、Co-AdsiBMP9组与对照组相比无明显变化(P0.05)；Western blotting检测瘦素信号通路相关分子的表达情况,结果显示Co-AdBMP9组p-ERK1/2、p-STAT3的表达明显降低(P0.05),Co-AdsiBMP9组与对照组相比明显升高(P0.05),但Co-AdBMP9组和Co-AdsiBMP9组p-Akt的表达均无明显变化(P0.05)：同时,Co-AdBMP9组leptin信号通路下游靶因子c-Myc、CyclinD1、MMP9、 VEGF的表达明显降低(P0.05),Co-AdsiBMP9组与对照组相比明显升高(P0.05)。③ Western blotting结果显示前体脂肪细胞3T3-L1的leptin表达水平在Co-AdBMP9组显著下调(P0.05),而Co-AdsiBMP9组leptin的表达水平与对照组相比明显升高(P0.05)；ELISA结果发现Co-AdBMP9组的leptin分泌量与对照组相比明显降低(P0.05),而Co-AdsiBMP9组与对照组相比明显升高(P0.05)；④动物实验结果表明：Co-AdBMP9组的皮下瘤体积明显比对照组小(P0.05),而Co-AdsiBMP9组瘤体明显增大于对照组(P0.05)；HE染色结果显示Co-AdBMP9组肿瘤细胞分化较对照组高,而Co-AdsiBMP9组肿瘤细胞的分化程度比照组低；免疫组纵化学梁色表明Co-AdBMP9组leptin、c-Myc、CyclinD1、MMP9、p-ERK1/2和p-STAT3的染色强度明显低于对照组,而Co-AdsiBMP9组的染色强度明显比对照组高。结论在体内外模拟乳腺脂肪微环境中,BMP9可以通过调节乳腺癌细胞和前体脂肪细胞的相互作用,从而抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移。其可能的机制为：BMP9抑制前体脂肪细胞3T3-L1分泌leptin,从而减少leptin与乳腺癌细胞上的OB-R结合,进而降低乳腺癌细胞中leptin信号通路相关分子的表达。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

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本文编号：1203589