shRNA干扰MACC1表达对结肠癌细胞迁移、侵袭力的影响及其相关上游信号通路研究

发布时间：2017-11-19 19:29

  本文关键词：shRNA干扰MACC1表达对结肠癌细胞迁移、侵袭力的影响及其相关上游信号通路研究

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【摘要】：目的:探讨RNA干扰抑制MACC1基因表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭的调控作用,初步探讨调控过程中可能涉及的上游信号通路。方法:(1)根据MACC1基因(7p21.1)核苷酸序列(NM_182762.3)设计并构建3个含不同RNA干扰片段的MACC1-sh RNA#1~3重组质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000介导,转染至人结肠癌SW620细胞株中,经嘌呤霉素筛选,得到稳定转染的SW620细胞株,同法获得阴性对照组细胞。(2)将获得的细胞株采用q PCR、Western Blot进行干扰效能检测并筛选出干扰效果最佳的稳定转染的SW620细胞株。(3)设立实验组(MACC1-RNAi#2/SW620细胞株)、阴性对照组(MACC1-control/SW620细胞株)和空白对照组(未处理的SW620细胞株),采用细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验观察RNA干扰后细胞的迁移、侵袭能力的变化。(4)应用蛋白激酶特异性抑制剂PD98059、Curcumin、Wortmannin、Dasatinib处理以上实验组、阴性对照组和空白对照组三组SW620细胞株,阻断可能影响结肠癌细胞侵袭力的分子通路:Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β、PI3K/ILK/PKB、Src/STAT3信号转导通路,通过q PCR检测上述三组SW620细胞中MACC1基因m RNA表达,筛选出MACC1基因在结肠癌SW620细胞迁移、侵袭力调控中所涉及的可能上游信号转导通路。结果:成功获得稳定转染的SW620细胞,通过嘌呤霉素筛选的细胞转染率达80%以上。稳定转染SW620细胞株干扰效能检测结果显示:与阴性对照组及空白对照组相比,稳定转染的SW620细胞株的MACC1基因m RNA及蛋白的表达降低,(P0.05)。干扰组之两两比较显示:MACC1-RNAi#2/SW620细胞株干扰效果最明显(P0.05)。细胞划痕实验结果表明:与对照组对比,实验组细胞(MACC1-RNAi#2/SW620细胞株)的迁移能力降低,(P0.05),差异具有统计学意义。Transwell小室侵袭实验结果显示:实验组细胞(MACC1-RNAi#2/SW620细胞株)的侵袭能力受到了显著抑制,(P0.05)。激酶特异性抑制剂处理的细胞q PCR检测结果显示:抑制剂抑制Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β及Src/STAT3信号转导通路后,SW620细胞株中MACC1基因m RNA表达下降,(P0.05)。抑制PI3K/ILK/PKB信号转导通路则对MACC1基因m RNA表达未见明显影响。结论:MACC1基因具有调控结肠癌SW620细胞迁移、侵袭能力的作用,并可能成为结肠癌分子治疗的潜在靶标。Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β和Src/STAT3通道可能参与了MACC1基因表达的上游信号转导调控。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

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本文编号：1204665