胃癌多药耐药相关分泌型糖蛋白的筛选与验证

发布时间：2017-11-19 21:06

  本文关键词：胃癌多药耐药相关分泌型糖蛋白的筛选与验证

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【摘要】：背景在中国,胃癌是第二大常见肿瘤同时也是第二大致死性肿瘤。尽管人们对胃癌多药耐药(Multi-drug resistance,MDR)的研究已取得了诸多进展,多药耐药的产生仍是胃癌患者化疗失败的主要原因。肿瘤多药耐药的发生是一个多分子、多信号通路参与的复杂的生物学进程,然而既往的研究大都关注于特定蛋白尤其是细胞内蛋白的分子表达对肿瘤多药耐药的作用,较少涉及蛋白翻译后修饰的研究。糖基化修饰是一种非常重要且常见的蛋白翻译后修饰,其对蛋白的正确折叠、构象形成乃至功能的发挥起着至关重要的调节作用。人们发现,蛋白的糖基化修饰极大地影响了肿瘤的形成、增殖、侵袭和迁移等生物学进程。此外,蛋白的糖基化修饰也影响着肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。研究发现,特定蛋白的糖基化修饰对肿瘤多药耐药的产生有着重要的意义,同时,肿瘤细胞特定糖型的变化也可能影响化疗药物对肿瘤的疗效。近年来,随着人们对肿瘤微环境在肿瘤发生和发展中重要作用的认识的不断深入,肿瘤细胞分泌型糖蛋白在肿瘤多药耐药过程中的关键作用也逐渐得到了广泛认可。关于分泌型糖蛋白参与胃癌多药耐药的研究已有诸多报道,但我们对分泌型糖蛋白的糖基化修饰尤其是位点特异性糖基化修饰在胃癌多药耐药中的作用仍不十分清楚。本项研究在我们以往对肿瘤细胞蛋白糖基化修饰工作的基础上,建立了完整的胃癌细胞分泌型糖蛋白位点特异性糖基化修饰的定性和定量分析方法,并筛选得到了一批和胃癌多药耐药产生密切相关的异常糖基化修饰的分泌型糖蛋白,为全面阐明胃癌多药耐药的发生机制提供了新思路。目的1.建立对胃癌细胞分泌型糖蛋白位点特异性糖型的定性和定量分析方法;2.通过高通量质谱分析,研究胃癌细胞分泌型糖蛋白的糖基化修饰在胃癌多药耐药过程中的变化;3.从糖基化修饰的角度,获得在胃癌多药耐药中具有潜在意义的分泌型糖蛋白,为以后的工作奠定基础。方法1.通过对胃癌细胞培养上清的超滤离心,得到高度浓缩的细胞分泌蛋白,随后用胰蛋白酶进行酶解;之后,通过亲水作用液相色谱实现对糖肽的高效富集;2.通过高通量质谱技术,获取完整糖肽以及切除糖链后肽段的质谱数据;3.通过自编软件Ar Mone从原始质谱数据中提取出位点特异性糖型数据,之后用Perseus软件对糖基化数据进行定量分析;4.通过Western blot实验和TCGA数据验证AXL与胃癌多药耐药之间的关系。结果1.胃癌细胞系分泌蛋白组数据集总的来讲,我们从三株胃癌细胞系(SGC7901,SGC7901/ADR和SGC7901/VCR)中共鉴定到了1033个N-连接糖基化位点(localization probability0.75),这些糖基化位点对应于436个非冗余的N-糖基化蛋白。此外,我们共鉴定出了2222个高可信的N-连接位点特异性糖型。之后,我们综合运用生物信息学软件和Uniprot数据库来确定所鉴定到的蛋白是否为分泌型糖蛋白,结果发现:272个糖蛋白为经典的分泌型糖蛋白,74个蛋白可经非经典的分泌途径分泌至胞外。这一结果从侧面证明了我们的分泌蛋白糖基化分析方法的高效性。2.胃癌多药耐药过程中N-糖基化位点占有率的变化与SGC7901相比,共有240个N-糖基化位点在SGC7901-ADR/VCR中发生了显著的改变(124个糖基化位点的占有率升高,116个糖基化位点的占有率降低)。此外,这些显著变化的糖基化位点主要对应于163个糖基化蛋白,表达上调的糖基化位点对应于84个糖蛋白,表达下调的糖基化位点对应于76个糖蛋白,3个糖蛋白同时包含上调的糖基化位点和下调的糖基化位点。进一步的生物信息学分析表明:上调的糖基化位点所对应的87个糖蛋白主要发挥结合活性(32.4%),受体活性(25.4%)和催化活性(23.9%);而下调的糖基化位点所对应的79个糖蛋白所具有的分子功能主要为催化活性(33.3%),受体活性(25.0%)和结合活性(25.0%)。3.胃癌多药耐药过程中位点特异性糖型的变化我们发现只有核心岩藻糖以及复合型多糖在胃癌细胞产生获得性耐药以后发生了显著的变化,而其他几种重要的糖型并没有表现出明显的改变。此外,我们进一步确定了SGC7901和胃癌耐药细胞系之间明显差异的位点特异性糖型。共有175个位点特异性糖型在胃癌耐药细胞的分泌蛋白中显著上升,而324个位点特异性糖型在胃癌多药耐药细胞的分泌蛋白中显著下调。有意思的是,我们发现一些糖基化位点既连接有表达上调的糖型也连接有表达下降的糖型,这充分说明了糖基化修饰的高度复杂性。总的来讲,106个糖蛋白中151个糖基化位点上的499个位点特异性糖型在胃癌多药耐药细胞和其亲本细胞中差异显著。4.胃癌多药耐药过程中显著差异的糖基化位点和位点特异性糖型的综合分析我们发现显著差异的位点特异性糖型所对应的糖基化位点与位点水平上显著变化的糖基化位点很少发生重合。此外,我们发现特定位点上所连接的差异表达的糖型不少于2个的糖蛋白共有57个,而这些糖蛋白中有33个已被报道和肿瘤的多药耐药相关。这一结果也从侧面证明了蛋白糖基化修饰和肿瘤多药耐药密切相关。5.AXL在胃癌多药耐药中作用的初步验证我们发现AXL m RNA的表达在胃癌多药耐药细胞中显著上升,此外,分泌型AXL在胃癌多药耐药细胞培养上清中的表达也有着明显的升高。更重要的是,基于TCGA数据库中的295例胃癌数据,我们发现胃癌组织中AXL m RNA的高表达预示着胃癌患者的预后不良。综上所述,我们首次证明了AXL在胃癌多药耐药过程中其糖基化修饰和蛋白表达都发生了显著的改变,提示分泌型AXL在胃癌多药耐药的产生中发挥着重要的作用。结论我们率先从组学层面系统地研究了胃癌细胞分泌型糖蛋白的位点特异性糖基化修饰,证明了胃癌细胞分泌型糖蛋白的糖基化位点以及位点特异性糖型在细胞产生获得性多药耐药后发生了显著改变。此外,进一步的分析发现某些糖基化修饰异常的分泌型糖蛋白可能在胃癌多药耐药的进程中发挥着重要的作用,这一结果表明对特定糖蛋白糖基化修饰的调节可能成为逆转胃癌多药耐药的潜在治疗靶点。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
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本文编号：1204891