抑癌基因PRSS8在结直肠癌中的机制研究

发布时间：2017-11-20 01:15

  本文关键词：抑癌基因PRSS8在结直肠癌中的机制研究

  更多相关文章： PRSS8 结直肠癌 Wnt/β-catenin Sphk1 EMT

【摘要】：背景在美国,结直肠癌(CRC)是排名第三的常见恶性肿瘤疾病,在与癌症相关的死亡原因中结直肠癌排名第二,转移是发生死亡的主要原因。数十年的研究显示,肿瘤抑制基因的失活或表达降低,和癌基因的激活或表达增高导致的致癌信号通路的激活比如Wnt/β-catenin,炎症信号等都与结直肠癌的发生和进展有关。人丝氨酸蛋白酶8,又被称为prostasin(PRSS8),最初被发现在前列腺和精液中表达非常高。目前的研究已经证实,PRSS8作为抑癌基因,对于前列腺癌,乳腺癌,膀胱癌,胃癌等的发生发展有着非常重要的影响。本研究通过基因表达谱分析,发现PRSS8在结直肠癌组织中表达明显降低,但是它在结直肠癌中的作用机制尚不清楚。目的以人结直肠癌组织标本,结肠癌细胞系和裸鼠以及基因敲除小鼠为研究对象,探讨PRSS8在结直肠癌发生发展过程中的作用机制。方法1.免疫组化,染色强度评估和生存期分析:使用免疫组织化学染色对含有282例有随访资料的结直肠癌组织和癌旁组织的组织芯片(TMA)进行检测,分析PRSS8蛋白在结肠癌和正常组织中的表达差异。另外,还使用免疫组化染色对包括72对食管癌组织和其相匹配的正常组织,117对肝癌组织和其相匹配的正常组织,46对前列腺组织和其相匹配的正常组织或腺瘤,75对乳腺癌组织和其相匹配的正常组织或腺瘤的组织芯片进行检测。染色强度根据0(没有染色),1(微弱染色),2(中度染色),3(重度染色)来计分,病人生存期通过Kaplan-Meier法和GraphPad Prism 5.0软件分析。2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR):从38例冰冻的结直肠癌组织和其配对的正常组织手术标本中提取总RNA,然后使用qRT-PCR方法检测PRSS8的mRNA表达水平。3.培养细胞,构建质粒,合成siRNA和转染:构建过PRSS8的表达质粒,以及sirna,培养hek29和结肠癌细胞系hct116,sw480,caco2,hct8细胞,转染细胞系。通过westernblot检测prss8的表达与wnt/β-catenin信号通路,sphk1/s1p/stat3/akt信号通路,emt信号通路的关系。通过mtt法检测结肠癌细胞系的增殖能力,通过流式细胞仪检测细胞周期的改变,通过划痕实验和transwell法检测结肠癌细胞的迁移和运动能力,使用red-phalloidin染色方法检测细胞骨架和形态学的改变,通过top/fop报告基因系统检测prss8对β-catenin转录活性的影响,通过免疫共沉淀和共定位分析来探讨prss8与sphk1之间的相互作用。4.裸鼠成瘤实验:将pflag-prss8稳定过表达的hct116细胞系和阴性对照组(1.5x106/只)分别皮下注射到8周左右的正常裸鼠背部两侧,每组十只裸鼠,接种30天后,杀死小鼠,取出背部肿瘤,统计肿瘤的大小(g)和体积(cm3),通过免疫组化和westernblot进行检测分析。5.sphk1+/+和-/-小鼠:将8周龄的sphk1+/+和-/-小鼠处死后,收集结肠组织,在福尔马林溶液中固定后,用prss8抗体进行免疫组化染色。通过aperioimagescope软件对免疫组化染色强度进行分析。结果1.免疫组织化学染色结果显示在结直肠癌组织中prss8蛋白的表达水平降低,而且与结直肠癌的病理分化程度和生存期成正相关。同结直肠癌相似,prss8的表达水平在食管癌和肝癌中较正常组织低。与以前的研究相一致,同乳腺和前列腺腺瘤相比,prss8在乳腺癌和前列腺癌中表达降低。另外,prss8的表达水平与食管癌,肝癌,乳腺癌和前列腺癌的分化呈正相关。2.qrt-pcr结果显示在结直肠腺瘤和结直肠癌中prss8mrna表达水平降低。3.westernblot结果显示:prss8过表达能够抑制emt信号通路,wnt/β-catenin信号通路,sphk1/s1p/stat3/akt信号通路;干扰prss8的表达能够激活emt信号通路,wnt/β-catenin信号通路,sphk1/s1p/stat3/akt信号通路。4.(1)通过mtt法绘制细胞生长曲线的结果显示:与对照组相比,prss8转染组细胞增殖能力被显著抑制,而prss8干扰组细胞的增殖能力显著增强。(2)划痕实验和transwell法结果显示:与对照组相比,prss8转染组细胞的迁移和运动能力被显著抑制,而PRSS8干扰组细胞的迁移和运动能力显著增强。PRSS8过表达能够导致SW480和HCT116细胞周期阻滞于G1/G2期,能够导致HCT116细胞发生细胞骨架和形态的改变。在HEK293细胞系中,过表达PRSS8能够抑制β-catenin/TCF4荧光素酶活性。免疫共沉淀和共定位分析结果显示,PRSS8与sphk1在细胞内能够形成复合物发挥作用。5.过表达PRSS8后能够明显抑制裸鼠肿瘤的生长,从肿瘤大小和体积上减缓肿瘤的生长。6.利用免疫组化染色,相对于sphk1+/+小鼠,sphk1-/-小鼠结肠组织中PRSS8表达水平升高。结论1.PRSS8在结直肠癌中是一个抑癌基因,可以抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力,以及EMT信号通路,Wnt/β-catenin信号通路,Sphk1/S1P/Stat3/Akt信号通路,与结直肠癌的发生发展密切相关。2.PRSS8与结直肠癌的病理分化程度和生存期呈正相关,可作为检测结直肠癌的发生和进展以及预测结直肠癌病人预后的生物标志物。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

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本文编号：1205556