ω-3多不饱和脂肪酸对结肠癌细胞的作用及机制研究

发布时间：2017-11-20 06:11

  本文关键词：ω-3多不饱和脂肪酸对结肠癌细胞的作用及机制研究

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【摘要】：目的已有报道ω-3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能够抑制肿瘤的发生和肿瘤细胞的增殖,但作用机制尚未完全清楚。YAP作为Hippo通路中的核心蛋白,在肿瘤的发生及增殖中起重要作用。本研究拟观察ω-3 PUFAs DHA和EPA对结肠癌细胞的作用;探讨相应的作用机理;揭示ω-3 PUFAs DHA和EPA作用于结肠癌细胞的信号通路,为预防结肠癌的发生和辅助治疗提供理论依据和候选药物。方法1.通过MTT法观察DHA和EPA对结肠癌细胞HT-29和LOVO增殖的影响;流式细胞术观察DHA和EPA对HT-29和LOVO细胞凋亡的影响。2.DHA和EPA处理HT-29和LOVO细胞,通过Western Blot检测上述细胞中YAP及其磷酸化YAP(p-YAP)的水平;并对比不同浓度梯度DHA和EPA的作用结果,确定最适作用浓度。3.DHA和EPA处理HT-29和LOVO细胞,激光共聚焦显微技术(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察细胞中YAP的核浆定位。4.采用RNA干扰技术沉默YAP的表达,DHA和EPA处理干扰YAP后的HT-29和LOVO细胞,通过实时荧光定量PCR检测上述细胞中YAP靶基因mRNA的变化。5.DHA和EPA处理HT-29和LOVO细胞后,通过Western Blot检测上述细胞中LATS及其磷酸化LATS(p-LATS)的变化。6.分别干扰Hippo通路中LATS及MST,DHA和EPA处理干扰后HT-29和LOVO细胞,通过Western Blot检测上述细胞中YAP及p-YAP的变化。7.通过免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测人结肠癌组织与正常肠组织中G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)GPCR40和GPCR120是否存在。8.分别干扰GPCR40和GPCR120,DHA和EPA处理干扰后HT-29和LOVO细胞,通过Western Blot检测上述细胞中LATS及p-LATS。9.在HT-29和LOVO细胞中过表达突变型的Gs蛋白后,DHA和EPA处理上述细胞,通过Western Blot检测上述细胞中p-YAP和p-LATS。10.用pka的抑制剂h89处理ht-29和lovo细胞,dha和epa处理上述细胞,通过westernblot检测上述细胞p-yap和p-lats。结果1.mtt实验结果表明dha和epa对结肠癌细胞的增殖有抑制作用,并且有时间和浓度依赖性。2.流式细胞术结果表明dha和epa促进结肠癌细胞的凋亡。3.westernblot结果表明dha和epa促进结肠癌细胞p-yap增加,且有时间和浓度依赖性。4.激光共聚焦试验结果显示:dha和epa能促进yap的核浆转移。5.实时荧光定量pcr结果显示:dha和epa处理结肠癌细胞后,yap的靶基因(促增殖基因及抗凋亡基因)在mrna水平上明显下降;dha和epa处理沉默yap后的结肠癌细胞,yap的靶基因(促增殖基因及抗凋亡基因)在mrna水平上不再变化,说明dha和epa降低这些基因mrna水平是通过yap起作用的。6.westernblot结果显示dha和epa使p-lats增加,且有时间和浓度依赖性。7.westernblot结果显示:分别干扰lats和mst后,p-yap水平下降,再用dha和epa处理细胞后不能使p-yap增加。8.免疫组织化学试验结果显示gpcr40和gpcr120在人结肠癌中表达。9.westernblot结果显示:分别干扰gpcr40和gpcr120后,再用dha和epa处理细胞后不能使p-yap和p-lats增加。10.在ht-29和lovo细胞中过表达突变型gs后,发现p-yap和p-lats下降,再用dha和epa处理细胞后不能使p-yap和p-lats增加。11.h89处理ht-29和lovo细胞,结果显示p-yap和p-lats下降,再用dha和epa处理细胞后不能使p-yap和p-lats增加。结论1.dha和epa对ht-29和lovo细胞有抑制其增殖并促进其凋亡的作用,且有时间和浓度依赖性。2.dha和epa能促进ht-29和lovo细胞中yap的磷酸化,且使蛋白yap的核内定位减少。3.dha和epa使蛋白yap的靶基因包括促增殖及抑凋亡基因的转录减少。4.DHA和EPA通过Hippo通路促进LATS的磷酸化。5.DHA和EPA通过与GPCR40和GPCR120结合,促进YAP和LATS的磷酸化。6.DHA和EPA通过Gs下游蛋白激酶PKA,与Hippo通路关联,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

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本文编号：1206343