CRKL过表达抑制小鼠肝癌Hca-P细胞体外增殖,迁移和侵袭能力

发布时间：2017-11-20 18:20

  本文关键词：CRKL过表达抑制小鼠肝癌Hca-P细胞体外增殖,迁移和侵袭能力

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【摘要】：背景:转移是恶性肿瘤主要生物学特征,涉及细胞外基质降解和细胞迁移等复杂过程,一直是肿瘤防治的重大课题和难点。淋巴结通常是恶性肿瘤转移的第一个器官,恶性肿瘤早期淋巴道转移是患者死亡率高预后性差的重要原因,是一个涉及多基因、多步骤的复杂过程,包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学过程,其转移机制不清。小鼠肝癌腹水型细胞株Hca-P和Hca-F是一对小鼠肝癌亚克隆细胞系,它们的遗传背景相同,但淋巴道转移潜能是显著不同的,其中Hca-P为低淋巴道转移力细胞(淋巴结转移率约25%),Hca-F为高淋巴道转移力细胞(淋巴结转移率约75%),是研究肿瘤淋巴道转移的理想细胞模型。信号接头蛋白CRKL,是CRK家族成员之一,在真核生物体内广泛表达,参与多种致癌信号通路,与一些癌症的临床病理学特征及预后密切相关,已成为肿瘤学研究的热点分子。本课题组前期采用Western blot技术研究发现,CRKL在Hca-P中的表达是Hca-F中的3.05倍(P0.05),并通过RNA干扰技术下调Hca-P细胞CRKL表达水平,发现CRKL下调明显促进Hca-P细胞淋巴道转移潜能,提示CRKL的表达水平与肿瘤淋巴道转移密切相关,可能是潜在的抑制肝癌淋巴道转移的靶标分子。目的:1.构建pc DNA3.1-V5/His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表达质粒;2.瞬时转染p EGFP-N1-CRKL质粒至小鼠肝癌Hca-P细胞,激光共聚焦定位CRKL-GFP融合蛋白;3.瞬时转染pc DNA3.1-V5/His B-CRKL质粒至小鼠肝癌Hca-P细胞,Western blot检测CRKL蛋白过表达水平;4.探究瞬时转染pc DNA3.1-V5/His B-CRKL质粒后,CRKL过表达对Hca-P细胞体外增殖、迁移、侵袭及克隆形成能力的影响,为进一步研究淋巴道转移机制奠定基础。方法:1.根据CRKL的CDS及pc DNA3.1/V5-His B和p EGFP-N1载体,对应设计引物对-1和引物对-2;2.RT-PCR方法扩增小鼠CRKL的CDS全长,产物纯化后与p EASY-blunt simple cloning vector进行克隆,获得原核克隆质粒p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2,分别进行单双酶切及测序鉴定。将原核克隆质粒、pc DNA3.1/V5-His B和p EGFP-N1空质粒分别进行双酶切,纯化目的片段并连接,获得pc DNA3.1/V5-His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表达质粒,并分别进行单双酶切及测序鉴定;3.采用Lipofectamine#174;2000转染试剂,将p EGFP-N1-CRKL及p EGFP-N1空质粒转染至小鼠肝癌Hca-P细胞,转染24小时后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,激光共聚焦显微镜定位CRKL-GFP融合蛋白;4.采用Lipofectamine#174;2000转染试剂,将pc DNA3.1/V5-His B-CRKL及pc DNA3.1/V5-His B空质粒转染至小鼠肝癌Hca-P细胞,转染24小时后,采用Western blot检测CRKL蛋白过表达水平;5.CCK-8法检测CRKL表达上调对Hca-P细胞增殖能力的影响,软琼脂克隆形成法检测CRKL表达上调对Hca-P细胞克隆形成能力的影响,Transwell小室法检测CRKL表达上调对Hca-P细胞体外迁移和侵袭能力的影响。结果:1.酶切及测序结果显示,p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2克隆质粒、pc DNA3.1-V5/His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表达质粒构建成功,重组质粒中CRKL序列完全正确;2.激光共聚焦结果显示,CRKL蛋白主要表达于细胞质中;3.Western blot结果显示,与pc DNA3.1/V5-His B-Hca-P和Hca-P组相比,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P组CRKL与CRKL-His总表达水平分别上调了1.69和1.39倍,且只有pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P组检测到CRKL-His Tag融合蛋白;4.CCK-8细胞增殖结果显示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P与对照组相比细胞增殖速度明显减慢;软琼脂克隆形成结果显示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P与对照组相比细胞克隆形成能力明显降低;Transwell小室结果显示,pc DNA3.1/V5-His B-CRKL-Hca-P与对照组细胞相比细胞迁移以及细胞侵袭能力显著下降。结论:1.成功构建了p EASY-blunt simple-CRKL-1和p EASY-blunt simple-CRKL-2克隆质粒;成功构建了pc DNA3.1/V5-His B-CRKL和p EGFP-N1-CRKL真核表达质粒;2.CRKL蛋白主要分布于Hca-P细胞质中;3.CRKL过表达抑制Hca-P细胞的增殖能力;4.CRKL过表达抑制Hca-P细胞的克隆形成能力;5.CRKL过表达抑制Hca-P细胞的迁移能力;CRKL过表达抑制Hca-P细胞的侵袭能力。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

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本文编号：1208032