Erbin反馈调控Akt-Skp2-p27通路影响肿瘤细胞增殖的研究

发布时间：2017-11-21 23:16

  本文关键词：Erbin反馈调控Akt-Skp2-p27通路影响肿瘤细胞增殖的研究

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【摘要】：背景Erbin(Erb B2 interacting protein),作为Erb B2一种新的结合蛋白,在2000年被发现并因此而命名。Erbin属于LAP蛋白家族的新成员,其结构主要包括:C端的一个PDZ结构域以及N端的16个串联的LRR结构域。Erbin通过PDZ结构域和Erb B2的C端特异性结合,引导Erb B2定位在基底膜,维持细胞的极性;并且作为支架蛋白通过其自身的结构域与其它相应蛋白的结构域相互作用进而发挥其功能。Erbin与β-catenin等连环蛋白相互作用,而进入细胞骨架网络,参与上皮细胞的粘附以及桥粒的形成。近年来研究发现,一些维持上皮细胞极性的分子同时参与细胞周期的调控。此外,Erbin作为接头蛋白,在特定条件下负性调控TGF-β/Smads、Ras/Raf-1/ERK以及Nod2/NF-κB细胞信号通路。由此可见,Erbin是一个“多种角色”的极性分子。迄今为止,Erbin还没有特异性的商品化抗体,我们实验室早期制备纯化了Erbin抗体,做Western blot实验时发现,敲低Erbin通过下调p21、p27具有促进肿瘤细胞增殖与迁移功能,并且在我们随后的研究中发现Erbin具有调节Akt-Skp2通路的功能。这些线索强烈的提示,Erbin在相关的癌基因功能中可能作为重要调控因子。但是Erbin是怎样调控Skp2介导的细胞增殖、迁移与相关癌基因功能的这些问题还没有被解决。Skp2由蛋白-蛋白相互作用模块、F-box序列、“Linker”序列依次连接而成(如亮氨酸重复结构域),是能与S期激酶Cyclin A-CDKI相互作用的蛋白。研究显示Skp2在不同种类的细胞中起主导作用的调控机制不同,其表达受转录及转录后水平的双重调控。为了抑制细胞增殖,可以通过调控Skp2的表达进而增加p27的稳定性来实现。在前列腺癌中的研究显示,抑癌基因蛋白PTEN的表达与Skp2的表达相关,由此推断抑癌基因PTEN参与Skp2表达的调控。PTEN基因在人类癌症中通常是缺失的,其通过抑制Akt信令发挥着肿瘤抑制基因的作用。因此对于因PTEN基因的功能缺损或失活而导致Akt信令解除控制的肿瘤来说,Skp2蛋白或可成为一个有效的治疗标靶。Skp2与细胞周期调控以及肿瘤的发生、发展和预后密切相关,这些都是通过其对多种靶蛋白的泛素化降解来实现的。在最近对Erbin的实验研究中,我们的实验结果显示Skp2作为Erbin的E3泛素连接酶存在。由此提示,Erbin和Skp2之间可能存在相互作用,并且Skp2介导的细胞增殖、迁移与相关癌基因功能可能依赖于Erbin。目的探讨Erbin通过Akt-Skp2-p27信号通路调控肿瘤细胞增殖的分子机制。方法(1)利用Western Blot实验,以不同的实验条件在多种细胞中检测Akt-Skp2-p27信号通路中多种内源性或外源性蛋白的表达情况。(2)应用免疫荧光(IF)实验,以不同的实验条件,在He La细胞中检测Erbin、Skp2在细胞中的定位变化。(3)经免疫共沉淀(Co-IP)实验,检测He La细胞中,敲低Erbin对Skp2磷酸化和乙酰化的影响;Erbin与Skp2是否存在相互作用。(4)经免疫组化实验,检测肿瘤组织中Erbin与Skp2的表达。(5)经ATP、EDU、集落形成、划痕实验,在He La细胞中检测细胞增殖或迁移。(6)利用体内实验建立移植瘤模型,检测Erbin丢失后癌细胞在体内的增殖。结果(1)Western Blot实验结果显示,下调Erbin通过p27的降解促进了内源性与外源性Skp2的稳定性;Akt-Skp2反馈信号调控Erbin表达。(2)免疫荧光(IF)实验检测到,Erbin主要定位在细胞膜和相邻细胞的连接处;敲低Erbin增强了Skp2蛋白的稳定性,但并未影响Skp2的定位,未观察到Akt激活引起Skp2胞质定位增加。(3)经免疫共沉淀(Co-IP)实验检测到,敲低Erbin促进Skp2的磷酸化和乙酰化;Erbin与Skp2存在相互作用。(4)经免疫组化实验观察到,在乳腺癌组织中,Erbin与Skp2的表达呈负相关。(5)经ATP、EDU、集落形成、划痕实验观察到,在He La细胞中,Erbin丢失促进细胞增殖,Erbin对细胞迁移行为的调控依赖于Skp2。(6)经体内实验,建立移植瘤模型后,发现Erbin丢失促进了癌细胞在体内的增殖。结论通过研究,我们证实:Erbin在多种上皮性肿瘤中表达失调,Erbin缺失导致细胞周期S期加快,增殖异常;揭示Erbin参与肿瘤细胞G1/S转换调控的分子机制。Erbin缺失促进Akt-Skp2-p27信号轴激活,而Akt-Skp2活化又促进Erbin降解;Erbin既是Skp2的降解底物又调控Akt依赖的Skp2蛋白稳定性及活性。总之,本研究揭示了一个Akt-Skp2-p27的负调控分子,并提示Erbin在维持细胞极性之外的的新功能,即作为细胞周期的刹车分子,在维持细胞周期正常行进中具有重要作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3

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本文编号：1212640